王雪芳，王春梅，張金林，段麗婕，王鎖民＊

（1.蘭州大學草地農業(yè)科技學院 草地農業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，甘肅 蘭州730020；2.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，甘肅 蘭州730050）

＊小花堿茅（Puccinelliatenuiflora）又名星星草，屬多年生禾本科堿茅屬草本植物，生長于草甸草原、鹽漬化土壤堿斑周圍［1］，多分布于哈薩克斯坦、阿爾泰到亞庫梯地區(qū)以及我國東北、內蒙古、華北、西北等地。由于其較強的耐鹽堿性，小花堿茅常成為草原區(qū)鹽化或堿化草甸的優(yōu)勢種，如今更逐漸成為改良和利用鹽堿地草原草甸的建群種，我國從20世紀80年代開始利用小花堿茅改良鹽堿地，取得了良好的效果。小花堿茅不僅可以綠化鹽堿地、改善生態(tài)環(huán)境，而且還可以改善土壤的理化性質，為其他農作物和牧草栽培提供可生存的環(huán)境，這些優(yōu)點使它成為了生物改良鹽堿地的首選草種之一［2］。

近年來，科學家們對小花堿茅的生理生態(tài)特性、對土壤理化性質的影響、抗鹽堿的解剖結構及離子吸收與分配的生理機制等方面進行了大量的研究［3－7］，亦克隆和鑒定了與其耐鹽性相關的一批基因［8－11］，但要進一步深入分析這些基因在小花堿茅適應鹽生境中的作用機制，尚亟待建立小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系。本研究以小花堿茅成熟種子為外植體，成功建立了完整的小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系，為進一步探究其耐鹽堿的分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

小花堿茅成熟種子于2009年8月采自蘭州大學榆中校區(qū)試驗田，陰干后置于－20℃冰箱中，次年選取籽粒飽滿的種子備用。

1.2 種子脫穎處理及消毒

選取成熟飽滿的種子置于研缽中，輕研數(shù)下后得到脫穎的褐色種子，分別將脫穎和未脫穎的種子置于超凈工作臺中，用75%的酒精消毒3min，再用5%的次氯酸鈉消毒10min，最后用無菌水沖洗3～5次。

1.3 愈傷組織的誘導

以 MS＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂（pH 7～8）為基本培養(yǎng)基，分別添加1）3mg／L 2，4－D；2）5mg／L 2，4－D；3）3 mg／L 2，4－D＋0.1mg／L 6－BA；4）5mg／L 2，4－D＋0.1mg／L 6－BA；5）7mg／L 2，4－D＋0.1mg／L 6－BA；6）5 mg／L 2，4－D＋0.3mg／L 6－BA作為愈傷組織的誘導培養(yǎng)基。然后將消毒后的種子接種于上述培養(yǎng)基上遮光培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿接種70粒種子，每種培養(yǎng)基10個重復。分別在2和4周后觀察、統(tǒng)計愈傷組織生長情況，并選擇生長良好的愈傷組織繼代2次，繼代周期為4周。

1.4 愈傷組織的分化

以 MS＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂（pH 7～8）為基本培養(yǎng)基，分別添加1）0.3mg／L 6－BA；2）0.5mg／L 6－BA；3）1.0mg／L 6－BA；4）1.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA；5）1.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA；6）3.0mg／L 6－BA＋0.2mg／L NAA作為愈傷組織的分化培養(yǎng)基。選取直徑約1cm左右生長良好的黃色顆粒狀胚性愈傷組織接種于上述培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，每個培養(yǎng)皿轉接10個愈傷組織塊，每種培養(yǎng)基6個重復。分別在2和4周后觀察、統(tǒng)計芽點分化情況。

1.5 生根培養(yǎng)與移栽

愈傷組織分化出芽點再經4周生長后，移植于1／2MS＋1%蔗糖＋0.7%瓊脂的培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。待組培苗生長至10cm左右時，開蓋后煉苗1周，然后將完整的再生植株移栽于營養(yǎng)土∶蛭石為3∶1的基質中，并保證溫室濕度，隔天澆水。

1.6 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度恒定保持（25±1）℃，愈傷組織分化和植株再生階段的光照強度為50μmol／（m2·s），光周期為16h／d。

1.7 統(tǒng)計分析方法

用SPSS 17.0進行方差分析和顯著性分析，用 Microsoft Excel 2003制圖。

2 結果與分析

2.1 種子脫穎處理

種子脫穎后，發(fā)芽率顯著提高，由7.6%增至50.8%，且污染率也有顯著降低（圖1），由此可見種子脫穎對種子發(fā)芽以及愈傷組織的誘導是至關重要的。因此，本研究后續(xù)試驗采用脫去穎殼的種子為外植體。

2.2 愈傷組織的誘導

將脫穎的小花堿茅種子接種于愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，3～4d后發(fā)芽，2周后在纖細的胚芽基部可見白色的愈傷組織，4周后的愈傷組織直徑約3mm左右，呈白色團狀，經1次繼代后，部分逐漸轉化為黃色顆粒狀。愈傷組織誘導率在一定范圍內隨著2，4－D濃度的增加而升高，當培養(yǎng)基中2，4－D濃度為5.0mg／L時，愈傷組織誘導率最高，達55.2%，此后，隨著2，4－D濃度繼續(xù)增加到7.0mg／L時，反而會抑制愈傷組織的誘導（表1），同時，在培養(yǎng)基中添加6－BA時，愈傷組織誘導率會下降，且水化狀態(tài)加重、生長緩慢。結果表明，誘導小花堿茅愈傷組織最適的激素配比濃度為5.0 mg／L 2，4－D，不添加6－BA。

表1 不同濃度激素配比對愈傷組織誘導的影響Table 1 Effects of various hormone ratios on callus induction in P.tenuiflora

2.3 愈傷組織的分化

將小花堿茅胚性愈傷組織轉接于分化培養(yǎng)基上光照培養(yǎng)，2周后開始出現(xiàn)綠色芽點，隨著6－BA濃度的增加，愈傷組織分化率逐漸提高，當6－BA的濃度增加到1.0mg／L時，分化率最高，達33.3%，進一步提高6－BA濃度至3.0mg／L時，分化率明顯下降（表2），由此可見促進胚性愈傷組織分化的最佳6－BA濃度為1.0mg／L。實驗還發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加NAA后，分化率雖沒有顯著提高，但隨著培養(yǎng)時間的延長，大部分胚性愈傷組織表面都會分化出許多毛狀根（圖2C），且NAA濃度越高，生根越明顯，其中當NAA的濃度為0.5mg／L時，生根率達到了81.7%。結果表明，誘導分化的最適激素濃度配比為0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA。

表2 不同濃度激素配比對小花堿茅愈傷組織芽分化和生根的影響Table 2 Effects of various hormone ratios on bud differentiation and rooting from callus in P.tenuiflora

2.4 生根和移栽

將分化出芽點并帶有根毛的愈傷組織移入1／2 MS＋1%蔗糖＋0.7%的培養(yǎng)基上，生根率達100%，且其根系發(fā)達（圖2D）。待組培苗生長至10cm左右時，開蓋煉苗1周，移栽后全部成活，生長良好（圖2G）。

圖1 小花堿茅種子脫穎處理對其發(fā)芽率和污染率的影響Fig.1 Effects of husk－off treatment on seed germination and contamination rates in P.tenuiflora

圖2 小花堿茅組織培養(yǎng)植株再生體系Fig.2 Plant regeneration system via tissue culture in P.tenuiflora

3 討論

3.1 種子脫穎處理對小花堿茅組織培養(yǎng)的影響

小花堿茅種子細小，呈紡錘形，外包被穎殼。穎殼顯著影響小花堿茅種子的發(fā)芽率，脫去穎殼后，種子發(fā)芽率提高了43.2%，污染率也得到了顯著降低（圖1）。這可能是由于種子穎殼潛伏的微生物使種子消毒困難，穎殼中含有的某種抑制物或穎殼妨礙了種子的呼吸從而抑制了種子的萌發(fā)。趙昕等［12］研究發(fā)現(xiàn)種子穎殼、種皮透性以及種子內含有的發(fā)芽抑制物質是結縷草種子休眠的主要原因；馬彩云等［13］研究發(fā)現(xiàn)，野生結縷草種子去穎后愈傷組織誘導率有顯著提高；李曉玲等［14］在建立小花堿茅組織培養(yǎng)體系時也發(fā)現(xiàn)去穎處理能夠得到較好的實驗結果。由此可見，脫穎處理對以種子為外植體的禾本科植物種子萌發(fā)和愈傷組織培養(yǎng)具有顯著的促進作用。

3.2 不同激素配比對小花堿茅愈傷組織誘導的影響

生長素類激素對禾本科植物的愈傷組織誘導、胚狀體的產生以及試管苗的快繁和生根有很重要的作用［14］，2，4－D是禾本科植物組織培養(yǎng)中公認的誘導愈傷組織效果最好的生長素類似物，這在高羊茅（Festucaarundinacea）、早熟禾（Poa）等［15－16］禾本科牧草及農作物大麥（Hordeumvulgare）［17］中都得到了證實，李曉玲等［14］的研究結果也表明，2，4－D在小花堿茅和朝鮮堿茅愈傷組織的誘導及繼代培養(yǎng)中起著重要的作用。一般認為以成熟種子作為外植體誘導愈傷組織時需要較高濃度的2，4－D，且單子葉植物所需2，4－D的濃度是雙子葉的10～20倍［18］，本研究發(fā)現(xiàn)，當2，4－D濃度增至5.0mg／L時，小花堿茅種子的愈傷組織誘導率達55.2%，較李曉玲等［14］研究的愈傷誘導率高1.9%，在2，4－D濃度達到7.0mg／L時，愈傷組織誘導率反而降低到38.6%（表1）。錢海豐和薛慶中［19］的研究也發(fā)現(xiàn)，當2，4－D濃度高于12mg／L時，高羊茅種子愈傷組織的誘導會受到嚴重抑制，這可能是因為生長素濃度過高提高了植物組織內多酚氧化酶的活性，從而增加了愈傷組織的褐化、降低了愈傷組織的誘導［20］。在植物愈傷組織誘導中，一般配合使用低濃度的細胞分裂素可提高愈傷組織的質量和誘導率，本研究中卻得到了相反的結果：0.1和0.3mg／L 6－BA均在一定程度上抑制了小花堿茅愈傷組織的誘導（表1）。李俊琴等［21］在研究新麥草（Psathyrostachysjuncea）幼胚愈傷組織誘導時也發(fā)現(xiàn)，添加6－BA反而會抑制其愈傷組織的形成。

3.3 不同激素配比對小花堿茅胚性愈傷組織分化和生根的影響

NAA是植物組織培養(yǎng)中常用的生長素類激素之一，在誘導愈傷組織分化時使用較多，其使用的濃度范圍是0.1～1.0mg／L。有研究報道禾本科牧草高羊茅和黑麥草（Loliumperenne）在分化時所用NAA濃度均為0.5 mg／L［20，22］，本研究中也發(fā)現(xiàn)當 NAA濃度為0.5mg／L時，小花堿茅分化率最高，達31.7%（表2）。也有研究報道NAA不僅有利于愈傷組織芽點的分化，同時還可促進組培苗生根［23］，本研究中也發(fā)現(xiàn)當NAA濃度為0.5 mg／L時，生根率達到了81.7%。生長素濃度低于細胞分裂素濃度時會促進植物芽的形成，且細胞分裂素起主導作用，6－BA是促進植物細胞分裂分化的激素，在愈傷組織分化中起主導作用，其濃度使用范圍為1.0～3.0 mg／L，本研究中發(fā)現(xiàn)0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA的激素配比是誘導小花堿茅愈傷組織分化與生根的最適激素配比，錢海豐和薛慶中［19］也在2.0mg／L 6－BA＋0.5mg／L NAA的分化培養(yǎng)基上誘導了高羊茅芽的分化和生根，本研究與其結果基本一致。

許多植物組織培養(yǎng)的研究證實，無任何激素的1／2MS培養(yǎng)基是組培苗生根的最適培養(yǎng)基，它能很大程度地提高組培苗移栽的成活率，本研究結果與其一致，小花堿茅胚性愈傷組織在1／2MS培養(yǎng)基上的生根率為100%。

4 結論

小花堿茅組織培養(yǎng)體系以脫穎后的種子為外植體，誘導愈傷組織的最適培養(yǎng)基為：MS＋5.0mg／L 2，4－D＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂；愈傷組織分化的最適培養(yǎng)基為：MS＋0.5mg／L NAA＋1.0mg／L 6－BA＋3%蔗糖＋0.7%瓊脂，同時伴隨大量毛狀根的發(fā)生；生根培養(yǎng)基為：1／2MS＋1%蔗糖＋0.7%瓊脂培養(yǎng)基，生根率可達100%，且移栽后全部成活。本研究建立的小花堿茅植株再生周期為16周左右。

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