劉會(huì)杰,李勝*,馬紹英,張品南,時(shí)振振,楊曉明

(1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所,甘肅 蘭州 730070)

豌豆(Pisumsativum)屬豆科(Fabaceae)蝶形花亞科(Faboideae)豌豆屬(Pisum)一年生攀緣草本植物[1]。它是糧菜飼兼用作物，小雜糧中主要的食用豆，具有極大的農(nóng)業(yè)潛在價(jià)值。豌豆還具有很高的生物固氮能力，有助于富集土壤中的營(yíng)養(yǎng)肥料減少生產(chǎn)成本，所以對(duì)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展起著重要的作用[2]。然而，我國(guó)西北地區(qū)淡水資源缺乏，土壤鹽漬化日趨嚴(yán)重[3-4]，并且伴隨著采礦、冶金以及鎘(Cd)處理等工業(yè)的發(fā)展，我國(guó)農(nóng)業(yè)土壤Cd污染問(wèn)題也不斷加劇。Cd是毒性最強(qiáng)的重金屬元素之一，被植物吸收后大部分富集在根部，從而抑制根系的正常生長(zhǎng)[5]，限制豆科植物與根瘤菌共生關(guān)系的建立，導(dǎo)致作物產(chǎn)量和品質(zhì)急劇降低，威脅著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境，因此對(duì)鹽漬土及Cd污染土壤的治理已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外的廣泛重視[6]。

隨著生物膜理論和研究技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的研究證實(shí)了生物膜在植物逆境脅迫中的重要性。研究表明膜傷害與植物低溫脅迫、水分脅迫、鹽脅迫和環(huán)境污染物脅迫(重金屬污染如Cd)有密切關(guān)系[7]。王芳等[8]研究指出100 mg/L的Cd處理使膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量增加，質(zhì)膜透性增大，Cd又能導(dǎo)致擬南芥(Arabidopsisthaliana)根尖H2O2的積累[9]，發(fā)生膜脂過(guò)氧化傷害，同時(shí)鹽脅迫導(dǎo)致黃瓜(Cucumissativus)根系MDA含量和電解質(zhì)滲漏率增加，生物膜受到傷害[10]。大量實(shí)驗(yàn)表明,各種逆境脅迫對(duì)植物的傷害首先表現(xiàn)為生物膜的傷害，而脅迫中產(chǎn)生的羥基自由基(·OH)是造成膜脂過(guò)氧化作用的主要因素。植物在逆境脅迫過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)[11-12]，主要是H2O2能通過(guò)Harber-weiss反應(yīng)產(chǎn)生更活躍、毒性更強(qiáng)的羥基自由基(·OH)[13]，當(dāng)其產(chǎn)生速度超出細(xì)胞抗氧化防御系統(tǒng)的清除能力時(shí)，就會(huì)引發(fā)一系列毒性效應(yīng)，造成對(duì)細(xì)胞的“氧化脅迫”，從而引發(fā)或加劇膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞衰老或死亡。因此可以認(rèn)為植物細(xì)胞內(nèi)H2O2的累積是植物逆境脅迫過(guò)程中發(fā)揮作用的重要因素，減緩植物細(xì)胞內(nèi)H2O2積累降低質(zhì)膜傷害程度是研究植物抗逆性的首要任務(wù)。那么施加外源H2O2就相當(dāng)于對(duì)植物細(xì)胞進(jìn)行直接的過(guò)氧化脅迫也是對(duì)高鹽高鎘脅迫的模擬，對(duì)外源H2O2脅迫產(chǎn)生緩解效應(yīng)的物質(zhì)則能直接緩解各種逆境脅迫對(duì)植物的傷害。

本試驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)外源H2O2脅迫抑制了豌豆初生根的正常向地性生長(zhǎng)并導(dǎo)致水平彎曲，機(jī)理尚不明確，猜想可能是高濃度H2O2對(duì)豌豆根系生物膜產(chǎn)生了氧化迫害。Demidchik等[14]研究發(fā)現(xiàn)外源H2O2處理可導(dǎo)致擬南芥根部Ca2+瞬間大量涌入。張春平等[15]指出外源Ca2+可提高紫蘇(Perillafrutescens)幼苗葉片中抗氧化物酶的活性，減輕氧化損傷，并顯著緩解鹽脅迫對(duì)紫蘇生長(zhǎng)的抑制作用，從而提高植株的耐鹽性。也有研究表明外源加入Ca2+可拮抗Cd對(duì)毛狀根生長(zhǎng)的抑制或毒害，減少毛狀根對(duì)Cd的吸收和吸附[16]。但關(guān)于外源Ca2+對(duì)H2O2脅迫下豌豆初生根生長(zhǎng)的相關(guān)研究報(bào)道甚少。本研究以豌豆“隴豌一號(hào)”為材料，在高濃度H2O2脅迫下施加不同濃度的外源Ca2+，測(cè)定了外源Ca2+對(duì)H2O2脅迫下的豌豆初生根膜脂過(guò)氧化指標(biāo)及相關(guān)的抗氧化酶系統(tǒng)變化，探討不同濃度Ca2+對(duì)H2O2脅迫下初生根膜脂過(guò)氧化的緩解效應(yīng)，尋求Ca2+對(duì)H2O2脅迫的緩解調(diào)節(jié)機(jī)制，以期為抗逆境脅迫的調(diào)控方法提供理論依據(jù)，同時(shí)為鹽漬土及鎘污染土壤的改良提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2013年4-7月在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。供試材料為早熟、矮莖、半無(wú)葉型豌豆新品種“隴豌一號(hào)”，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所提供。H2O2和Ca2+的供體分別為30% H2O2和CaCl2，2種供體均為國(guó)產(chǎn)分析純(天津光復(fù)精細(xì)化工研究所)。

1.2 試驗(yàn)處理

挑選籽粒飽滿、均勻一致的豌豆種子，消毒后用蒸餾水沖洗3～4次，然后用吸水紙吸干。將處理好的種子放入直徑為15 cm且底部鋪有紗布的大培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中(26±2)℃下進(jìn)行培養(yǎng)，光照時(shí)間為24 h，光照強(qiáng)度為2000 lx。每個(gè)培養(yǎng)皿60粒種子，3次重復(fù)，每12 h更換處理液，處理液濃度如表1，CK組只加蒸餾水。以上所有的豌豆種子均水平放置在培養(yǎng)皿的底部，即胚根的方向與培養(yǎng)皿的底面相平行。脅迫所用的H2O2濃度為預(yù)試驗(yàn)得出的80 mmol/L的適宜濃度。

表1 試驗(yàn)處理Table 1 Treatments of the experiment

1.3 幼根相關(guān)生理指標(biāo)的測(cè)定

豌豆種子萌發(fā)72 h后拍照，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后將幼苗從培養(yǎng)皿中取出，根部用蒸餾水清洗，測(cè)定不同處理下初生根的各項(xiàng)生理指標(biāo)。

用TTC法測(cè)定初生根根系活力[17]，雙酶法[18]測(cè)定初生根內(nèi)源H2O2含量。丙二醛(MDA)含量參照Velikova等[19]的硫代巴比妥酸(TBA)法檢測(cè)。相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定參照李合生[20]的方法。

酶液的制備：分別取各處理的初生根液氮研磨后，加入5 mL 50 mmol/L預(yù)冷的磷酸緩沖液(pH 7.8)，轉(zhuǎn)入離心管中在4℃下離心20 min，上清液即為待測(cè)酶液。

超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍(lán)四唑(NBT)法檢測(cè)[21]，以抑制NBT光化還原50%所需的酶量為1個(gè)酶活力單位(U)。過(guò)氧化氫酶(CAT)活性檢測(cè)采用鉬酸銨比色法進(jìn)行測(cè)定[22]。借鑒陸曉民等[23]的方法測(cè)定過(guò)氧化物酶(POD)活性，以每分鐘OD值變化0.01為1個(gè)酶活性單位(U)?？箟难徇^(guò)氧化物酶(APX)的測(cè)定參照Mishra等[24]的方法。每種指標(biāo)每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel軟件處理數(shù)據(jù)和繪圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用Duncan’s新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)豌豆初生根生長(zhǎng)的影響

圖1 不同處理對(duì)豌豆初生根發(fā)生水平彎曲的效應(yīng)Fig.1 Effect of different treatments on horizontal bending of pea primary roots

圖2 不同處理對(duì)豌豆初生根彎曲率的影響Fig.2 Effects of different treatments on curving rate of pea primary roots 不同小寫(xiě)字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。Different small letters indicate statistically significant differences according to test (P<0.05). The same below.

圖3 不同處理對(duì)豌豆初生根內(nèi)源H2O2的影響Fig.3 Effects of different treatments on endogenous H2O2 of pea primary roots

將清洗干凈的豌豆種子水平放置在盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h時(shí)，豌豆種子開(kāi)始萌發(fā)，胚根開(kāi)始突破種皮，由于重力作用，豌豆的初生根開(kāi)始沿著重力的方向發(fā)生向地性彎曲(圖1,CK)。然而，如果將豌豆種子同樣水平放置在盛有H2O2的培養(yǎng)皿中，則向地性生長(zhǎng)完全受到抑制，而發(fā)生水平方向的彎曲，這種彎曲的方式，不同于向地性的生長(zhǎng)。試驗(yàn)中用高濃度(80 mmol/L)H2O2處理的豌豆種子，初生根72 h后水平彎曲弧度大于360度(圖1,CK1)。若在施加外源H2O2(80 mmol/L)的前提下同時(shí)加入不同濃度的Ca2+，這種水平彎曲的現(xiàn)象將會(huì)得到緩解，并且隨著Ca2+濃度的增加緩解效應(yīng)越明顯(圖1)。

試驗(yàn)中以彎曲大于90度以上的初生根數(shù)量占初生根總數(shù)的百分比計(jì)算初生根的彎曲率。結(jié)合圖2更能說(shuō)明Ca2+可以緩解外源H2O2誘導(dǎo)的豌豆初生根水平彎曲的現(xiàn)象。從圖2中可知,在CK1處理下,72 h后初生根彎曲率高達(dá)79.13%，隨著外源Ca2+濃度的增加，初生根的彎曲率顯著降低。Ca2+濃度增加到10 mmol/L時(shí)(T4)，初生根彎曲率降低為14.74%，是外源H2O2脅迫下(CK1,79.13%)的1/5。在Ca2+濃度大于10 mmol/L后緩解趨勢(shì)減弱，差異不顯著。

2.2 不同處理對(duì)豌豆初生根內(nèi)源H2O2的影響

在正常的狀態(tài)下，清除系統(tǒng)會(huì)保持植物細(xì)胞內(nèi)H2O2產(chǎn)生和清除的一種動(dòng)態(tài)平衡。但是，當(dāng)遇到環(huán)境的脅迫時(shí)如鹽、干旱、低溫等，H2O2的含量會(huì)快速升高[25]。為了研究外源H2O2處理后，是否引起了豌豆初生根細(xì)胞內(nèi)H2O2水平的變化，采用雙酶法定量檢測(cè)了 H2O2含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CK組相比，CK1處理內(nèi)源的H2O2含量顯著降低，即CK1初生根的內(nèi)源H2O2含量(1.034 mmol/L·g)明顯低于CK(1.4913 mmol/L·g)。但是豌豆種子浸泡在施加了外源Ca2+的培養(yǎng)皿中72 h后，因施加濃度的不同變化也各有差異。當(dāng)施加的外源Ca2+濃度從2.5 mmol/L到7.5 mmol/L的處理中初生根的內(nèi)源H2O2水平無(wú)顯著差異，但顯著低于其他處理。當(dāng)Ca2+濃度大于10 mmol/L時(shí)，初生根內(nèi)源H2O2含量則顯著高于CK1和低濃度Ca2+處理，較CK差異不顯著。試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，外施Ca2+能緩解H2O2脅迫下造成的內(nèi)源H2O2含量的降低，當(dāng)外施Ca2+達(dá)到一定濃度時(shí)，初生根內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生可恢復(fù)至正常生長(zhǎng)水平(圖3)。

2.3 不同處理對(duì)豌豆初生根根系活力的影響

眾所周知，在正常的植物生長(zhǎng)代謝中，H2O2作為代謝的副產(chǎn)物會(huì)源源不斷地產(chǎn)生，因此內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生與植物組織器官的代謝和生長(zhǎng)活力緊密相關(guān)。有些實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)植物在遭受外界因子的脅迫或者刺激時(shí)，內(nèi)源H2O2水平會(huì)迅速的升高，轉(zhuǎn)換成信號(hào)進(jìn)行細(xì)胞調(diào)節(jié)[26]。為什么在本試驗(yàn)中外源H2O2處理后內(nèi)源H2O2水平會(huì)降低，而在施加一定高濃度的外源Ca2+后又重新升高呢，為了闡明這一問(wèn)題，用TTC法測(cè)定了初生根的根活力。根的活力是一種能夠反映植物生長(zhǎng)代謝旺盛程度的一個(gè)重要指標(biāo)。無(wú)色的TTC在接受細(xì)胞中線粒體上脫氫酶?jìng)鬟f的電子后轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t色的TF[27-28]。因此根的活力與初生根的TF染色程度或者TF的含量呈正相關(guān)。

圖4 不同處理對(duì)豌豆初生根根系活力的影響Fig.4 Effects of different treatments on root activity of pea primary roots A：不同處理下初生根根系活力值；B：不同處理下初生根TTC法染色效果。 A：Values of primary root activity under different treatments; B：Dyeing effect of TTC on pea primary root under different treatments.

檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，外源H2O2降低豌豆初生根的根系活力，而同時(shí)施加外源Ca2+時(shí)根系活力又隨著Ca2+濃度的增加而增強(qiáng)，體現(xiàn)了其緩解效應(yīng)，如圖4A，而染色反應(yīng)也印證了這一結(jié)果(圖4B)。從圖4A可看出，正常生長(zhǎng)情況下(CK)初生根的根系活力達(dá)到219.225 μg/(g·h)，是H2O2處理63.429 μg/(g·h)的3.45倍。當(dāng)Ca2+濃度為2.5 mmol/L時(shí)豌豆初生根根系活力并沒(méi)有得到顯著提高，隨著外源Ca2+濃度的增加根系活力逐漸恢復(fù)，當(dāng)Ca2+濃度增大至10 mmol/L時(shí)(T4)初生根的根系活力達(dá)到194.849 μg/(g·h)，但與T3相比并不明顯，也顯著低于CK。當(dāng)Ca2+濃度大于10 mmol/L時(shí)，根系活力又顯著降低，在Ca2+濃度為15 mmol/L (T6)時(shí)根系活力降低為135.779 μg/(g·h)，雖然高于CK1，但顯著低于CK、T3和T4。

圖4B中可以觀察到，CK培養(yǎng)的豌豆種子初生根活力最強(qiáng)，整個(gè)初生根幾乎都被染成了TF的粉紅色。當(dāng)用H2O2處理72 h后，初生根的根系活力明顯下降，即染色非常淺或者染不上色(圖4B,CK1)。在施加高濃度的Ca2+后，初生根又能夠被TTC染上色，這表明根系活力得到恢復(fù)，但結(jié)合圖4A的數(shù)據(jù)分析仍明顯低于CK。在植物的正常生長(zhǎng)代謝中，H2O2作為信號(hào)因子不斷地產(chǎn)生，參與植物組織器官的代謝。本試驗(yàn)結(jié)果表明，正常處理的豌豆初生根生長(zhǎng)過(guò)程中，根的活力強(qiáng)，代謝旺盛，H2O2作為信號(hào)因子產(chǎn)生參與細(xì)胞的調(diào)控，因此內(nèi)源的H2O2含量高(圖3)；反之，外源H2O2處理后，初生根活力明顯受到抑制，因而使初生根自身內(nèi)源H2O2產(chǎn)生含量降低，恢復(fù)后根的活力又明顯地反彈。TTC染色的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與定量檢測(cè)的結(jié)果一致(圖4B)。

2.4 不同處理對(duì)豌豆初生根膜脂過(guò)氧化和質(zhì)膜透性的影響

膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物 MDA 含量及相對(duì)膜透性是細(xì)胞膜受損傷程度的重要指標(biāo)。由圖5可知，不論是在單獨(dú)H2O2處理下或者同時(shí)施加Ca2+處理，培養(yǎng)72 h后的豌豆初生根中MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率均比同期CK組升高，但是外施Ca2+降低了MDA含量和相對(duì)電導(dǎo)率的增加幅度。

圖5A顯示，CK1處理豌豆初生根MDA含量較之CK提高了97.40%，同時(shí)施加外源Ca2+后初生根MDA含量與CK1相比顯著降低，但仍高于CK組，且差異顯著。在T5處理下即Ca2+濃度為12.5 mmol/L時(shí)初生根MDA含量降低至與CK組無(wú)顯著差異，降低至CK1組的61.36%，為0.6732 μmol/(L·g)，Ca2+濃度增加至15 mmol/L時(shí)，MDA含量又有所升高，為0.8086 μmol/(L·g)。

從圖5B可以看出,各處理組相對(duì)膜透性的變化趨勢(shì)與MDA含量的變化趨勢(shì)相似，CK1的相對(duì)膜透性(31.94%)是CK (14.16%)的2.25倍，且與低濃度Ca2+處理T1無(wú)顯著差異。之后，隨著外源Ca2+濃度的增加相對(duì)膜透性逐漸降低，但仍高于CK，T5與T6組則差異不顯著。

圖5 不同處理對(duì)豌豆初生根MDA(A)和相對(duì)膜透性(B)的影響Fig.5 Effects of different treatments on MDA (A) and relative membrane permeability (B) of pea primary roots

2.5 不同處理對(duì)豌豆初生根抗氧化物酶活性的影響

本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與CK相比，CK1使豌豆初生根內(nèi)的POD (圖6A)、SOD(圖6B)和CAT(圖6C)的活性顯著降低，APX活性(圖6D)則與CK無(wú)顯著差異。H2O2脅迫下,POD、SOD和CAT的活性均隨著外施Ca2+濃度的增大顯著增加，且在T4達(dá)到最大值后隨之降低，APX活性則在T4、T5和T6處理無(wú)顯著差異。

如圖6所示，CK1的POD和CAT活性顯著低于CK。CK1豌豆初生根的POD活性降低為CK組的55.19%(圖6A)，CAT的活性降低為CK的37.29%，降低幅度比POD更大(圖6C)。同時(shí)施加Ca2+處理后，POD和CAT的活性顯著提高，在T4處理下均達(dá)最大值，分別為51.946 U/(mg·min)和1.9739 mmol/(L·g·min)，是對(duì)應(yīng)CK1的3.22和2.99倍。T4處理下POD活性相對(duì)于CK組的增加幅度比CAT更大，T4組POD活性比CK增加了78.28%，CAT活性則增加了13.87%，T5和T6處理下POD和CAT活性均有明顯降低，但都高于CK1(圖6A,C)。

SOD是一種重要的抗氧化酶類，能保護(hù)植物細(xì)胞受到氧化傷害。如圖6B所示，CK1組SOD活性比CK組降低了9.828%，隨著施加外源Ca2+濃度的增加，SOD活性隨之顯著增加，在T4處理下活性達(dá)到865.174 U/g FW，比CK和CK1分別高出101.06和172.026 U/g，均差異顯著。T5、T6處理下，酶活性降低，但是仍高于CK1，與CK組相比差異不大。

APX是清除細(xì)胞內(nèi)H2O2的主要酶類。如圖6D所示，在CK1處理下APX活性并沒(méi)有像其他抗氧化酶類一樣降低，卻與CK無(wú)顯著差異。但施加外源Ca2+后酶活性又有顯著的提高，當(dāng)Ca2+濃度增加到10 mmol/L (T4)達(dá)到穩(wěn)定，與T5、T6無(wú)顯著差異。

3 討論

3.1 外源Ca2+對(duì)H2O2脅迫下豌豆初生根生長(zhǎng)的緩解效應(yīng)

大量研究表明，施加低濃度外源H2O2對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有著積極的作用，例如能夠促進(jìn)種子萌發(fā)、增強(qiáng)很多植物的抗干旱、抗低溫、耐鹽等能力[29-31]。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，對(duì)豌豆外施高濃度(80 mmol/L)H2O2能抑制初生根正常向地性生長(zhǎng)并發(fā)生水平彎曲現(xiàn)象(圖1,CK1)。眾所周知，向地性生長(zhǎng)與細(xì)胞內(nèi)的H2O2信號(hào)有關(guān)，也許是外源的H2O2擾亂了細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡，加劇了膜脂過(guò)氧化作用，造成細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害，從而導(dǎo)致了一系列的反應(yīng)，使對(duì)重力的刺激信號(hào)無(wú)法向下傳遞。試驗(yàn)結(jié)果表明,外源施加Ca2+能明顯的緩解H2O2對(duì)豌豆初生根的傷害，使其恢復(fù)正常生長(zhǎng)。

圖6 不同處理對(duì)豌豆初生根POD(A)，SOD(B),CAT(C)和APX(D)活性的影響Fig.6 Effects of different treatments on POD(A), SOD (B), CAT(C) and APX(D) activity of pea primary roots

根系活力是根生長(zhǎng)或者代謝旺盛程度的一個(gè)重要指標(biāo)，根系活力的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，初生根的活力也明顯受到了外施H2O2的抑制(圖4)，這表明根細(xì)胞的正常代謝也受到了外源的H2O2抑制。施加外源Ca2+能夠有效地緩解H2O2誘導(dǎo)的水平彎曲生長(zhǎng)，使根系生長(zhǎng)趨于正常，根系活力得到恢復(fù)(圖4)。

一般認(rèn)為，外源H2O2是一種特殊的化學(xué)物質(zhì)，對(duì)植物的根產(chǎn)生脅迫。當(dāng)植物受到逆境脅迫后，內(nèi)源的H2O2水平會(huì)明顯的升高從而產(chǎn)生信號(hào)。但本研究結(jié)果與這一結(jié)論恰恰相反，在檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)的H2O2水平后發(fā)現(xiàn)，H2O2脅迫下初生根內(nèi)源H2O2(CK1)水平明顯低于正常處理下(CK)初生根內(nèi)源H2O2水平(圖3)。因此認(rèn)為，面對(duì)持續(xù)的外源H2O2處理，豌豆的種子或胚發(fā)生了自發(fā)的調(diào)節(jié)和反饋的抑制，抑制了自身的生長(zhǎng)和代謝。植物根系通過(guò)呼吸作用產(chǎn)生的H2O2是其主要來(lái)源之一，本試驗(yàn)中H2O2脅迫使初生根代謝降低，呼吸作用減弱，產(chǎn)生的H2O2也隨之減少。施加一定濃度的外源Ca2+后根系活力及代謝得以恢復(fù)，內(nèi)源H2O2含量也隨之升高。

3.2 外源Ca2+對(duì)H2O2脅迫下豌豆初生根膜脂過(guò)氧化和抗氧化酶系統(tǒng)的緩解

有研究表明高鹽脅迫使植物的生長(zhǎng)受到嚴(yán)重的阻礙，生物膜受到傷害[32]。王賀正等[33]指出水稻結(jié)實(shí)期隨水分脅迫加劇，細(xì)胞膜脂過(guò)氧化加劇。目前有關(guān)鋁誘導(dǎo)大豆的氧化脅迫也有報(bào)道，結(jié)果顯示高鋁脅迫使大豆根系質(zhì)膜透性增大，使植株抵抗逆境的能力下降受到傷害[34]。當(dāng)豌豆初生根受到脅迫時(shí)，首先受到傷害的是細(xì)胞膜，這很大程度上是通過(guò)破壞細(xì)胞生物膜的生理功能引起的，主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞和功能的紊亂以及膜透性發(fā)生變化，而細(xì)胞膜的破壞將加速整個(gè)細(xì)胞的傷害。而當(dāng)植物體受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)的MDA含量會(huì)升高，并且氧化程度越高，含量越高。

本研究中豌豆初生根的相對(duì)膜透性及MDA含量在不同的處理下均有不同程度的變化。H2O2處理導(dǎo)致初生根MDA含量的積累，相對(duì)膜透性增加。施加外源Ca2+后結(jié)果顯示，外施Ca2+有效減緩了初生根中MDA的升高，同時(shí)降低了細(xì)胞膜的相對(duì)透性，對(duì)細(xì)胞膜具有較好的修復(fù)和保護(hù)作用，從而減輕了外源H2O2對(duì)豌豆初生根細(xì)胞膜系統(tǒng)的傷害。

在遭受長(zhǎng)時(shí)間各種逆境脅迫后植物的抗氧化系統(tǒng)包括SOD、 CAT、APX、ASC、GSH、GPX、POD等一些抗氧化的酶或者抗氧化劑均會(huì)降低或者減少。本試驗(yàn)檢測(cè)了 CAT、SOD、POD和APX的活性，與大多數(shù)的研究結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)在外源H2O2處理下4種酶活性均明顯的降低(圖6)。柳斌等[35]曾報(bào)道施加外源鈣能緩解NaCl對(duì)苜蓿(Medicagosativa)幼苗根系的傷害。10 mmol/L的Ca2+能有效防護(hù)鹽脅迫導(dǎo)致的氧化損傷，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用[36]。同時(shí)，外源Ca2+能通過(guò)維持高的總抗氧化能力和抗氧化物質(zhì)含量等途徑來(lái)增強(qiáng)黑藻對(duì)Cd脅迫的抗性[37]。本研究結(jié)果表明，外源Ca2+對(duì)CAT、SOD、POD和APX等酶活性具有明顯的促進(jìn)作用，外施Ca2+后4種抗氧化酶活性持續(xù)升高。這個(gè)結(jié)果解釋了為什么內(nèi)源H2O2水平會(huì)降低，同時(shí)也證明強(qiáng)大的清除系統(tǒng)緩解了逆境脅迫下產(chǎn)生的過(guò)量ROS造成的氧化脅迫，降低初生根的膜脂過(guò)氧化程度，保護(hù)初生根不被傷害。

4 結(jié)論

直接施加外源H2O2使豌豆初生根內(nèi)MDA含量增加，相對(duì)膜透性增強(qiáng)，抗氧化物酶活性降低，對(duì)初生根造成膜脂過(guò)氧化傷害從而影響根系的正常生長(zhǎng)。而同時(shí)施加10 mmol/L外源Ca2+能有效地緩解H2O2對(duì)豌豆初生根造成的氧化脅迫，減輕對(duì)細(xì)胞膜的傷害，降低質(zhì)膜透性及MDA含量，增強(qiáng)初生根系抗氧化物酶活性，因此施加外源Ca2+能有效地緩解逆境脅迫對(duì)植物造成的氧化傷害。同時(shí)對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中鹽漬及污染土壤的改良除了調(diào)整作物品種和改變耕作制度的方法外，外源施加一定濃度的Ca2+也是一種有效的技術(shù)手段。