林新堅(jiān)，蘭忠明，張輝，王飛，何春梅

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究中心，福建 福州350013）

低分子量有機(jī)酸是指相對(duì)分子質(zhì)量＜500的含羧基化合物，是土壤中廣泛存在的一類非?；顫姷奈镔|(zhì)。它們主要來(lái)源于土壤表層動(dòng)植物殘?bào)w的分解、微生物的代謝作用、植物根系的分泌物和施入土壤有機(jī)物的轉(zhuǎn)化［1－3］。低分子量有機(jī)酸是植物根系分泌物中最為重要的成分，它們?cè)陴B(yǎng)分活化、改變土壤微生物活性以及緩解金屬元素毒害脅迫方面發(fā)揮重要作用［4］。不少研究結(jié)果表明，許多植物的根系如白羽扇豆（Lupinusalbus）［5－8］、木豆（Cajanuscajan）［9－10］、大麥（Hordeumvulgare）［11］、菜豆（Phaseolusvulgaris）［12－13］等都能夠分泌大量的低分子量有機(jī)酸（檸檬酸、蘋(píng)果酸、草酸、丙二酸、琥珀酸和酒石酸等），這些低分子量有機(jī)酸能夠溶解部分難溶性磷，提高土壤磷素有效性進(jìn)而促進(jìn)植物活化吸收利用難溶性磷酸鹽的作用［14－16］。有研究表明，根系分泌有機(jī)酸的分泌量是植物本身的反應(yīng)特征，受植物的種類、遺傳特性的影響。因而，不同作物品種有機(jī)酸分泌量存在很大差異，且同一作物種類不同基因型其有機(jī)酸分泌量也存在差異。有學(xué)者提出，提高磷有效性最有效的途徑，就是培育耐低磷及磷高效利用品種［17］。在低磷條件下，植物主要通過(guò)還原和絡(luò)合反應(yīng)提高土壤中難溶性磷的生物有效性，有機(jī)酸的分泌也能活化土壤中的難溶性磷［18］，從而促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收。目前有用化學(xué)浸提法研究有機(jī)酸對(duì)幾種人工合成磷酸鹽（Ca2－P、Fe－P和Al－P）的活化作用，發(fā)現(xiàn)低分子質(zhì)量有機(jī)酸對(duì)難溶性磷酸鹽的活化能力與有機(jī)酸種類、濃度有關(guān)，有機(jī)酸濃度增加，磷酸鹽溶解度增加，這主要是有機(jī)酸能與土壤中難溶性化合物中陽(yáng)離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，促進(jìn)難溶性養(yǎng)分的溶解，從而釋放難溶性養(yǎng)分。目前國(guó)內(nèi)對(duì)植物根系分泌物的研究，大多集中在水培和沙培研究，對(duì)在土培或原位條件下（能夠很大程度上反映田間條件下真實(shí)分泌情況）收集植物根系分泌物研究報(bào)道較少，因此本研究嘗試分析不同紫云英（Astragalussinicus）基因型在土培條件下根系分泌物中有機(jī)酸成分及差異。

1 材料與方法

1．1 供試材料

供試紫云英品種有9個(gè)：1－閩紫1號(hào)，2－信陽(yáng)種，3－閩紫7號(hào)（8324411），4－8487711，5－浙紫5－12，6－閩紫6號(hào)，7－余江大葉，8－84341022，9－弋江籽，3次重復(fù)。試驗(yàn)于2011年11月1日播種，2012年2月8日收集根系分泌物并采收。紫云英種植在黑色塑料袋內(nèi)，規(guī)格為直徑15cm，高度12cm。培養(yǎng)基質(zhì)為土壤與蛭石混合，重量為1 kg，土壤與蛭石比重約6∶1，攪拌混勻裝袋。供試土壤為水稻土，其土壤本底養(yǎng)分分別為堿解氮117．3mg／kg，有效磷30．2mg／kg，速效鉀69．8mg／kg，pH 5．01，有機(jī)質(zhì)18．0g／kg，全磷0．51g／kg。

1．2 根系有機(jī)酸收集

紫云英根系有機(jī)酸收集：采用抖土法將根系松散結(jié)合的土壤抖落，剩余的與根系緊密結(jié)合的土壤為根際土，把根與根際土一同浸入50mL去離子水塑料紙杯中，培養(yǎng)4h，取出根系，充分混勻土壤懸濁液，用定量濾紙202將根系分泌物溶液過(guò)濾到容積為50mL塑料瓶中，定容到40mL（即為紫云英根系分泌物），放置－20℃冷凍冰箱保存?zhèn)溆?。清洗根部，用剪刀剪植株地上莖葉和根部，分別裝入信封，在105℃下殺青30min后，均勻穩(wěn)定在75℃下，48h烘至恒重。

1．3 有機(jī)酸測(cè)定方法

土培條件下收集的紫云英根系分泌物上Waters2695高效液相色譜儀（HPLC）。樣品和標(biāo)樣的前處理：用平頭注射器吸取1mL樣液，過(guò)0．45μm水相濾膜，等待進(jìn)樣。流動(dòng)相：0．04mol／L磷酸二氫鉀－磷酸緩沖溶液，pH為2．40。流速：1．0mL／min，進(jìn)樣量：5μL，溫度：35℃，色譜柱：菲羅門柱，4．6mm×250mm，檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器Waters2996。有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的配制：分別稱取草酸500mg，酒石酸500mg，蘋(píng)甲酸500mg，檸檬酸500mg，馬來(lái)酸500mg，琥珀酸20mg，這6種有機(jī)酸定容體積都為10mL；分別吸取甲酸、乳酸、乙酸各5mL，定容體積分別為25，50和50mL?；鞓?biāo)1：上機(jī)濃度9種酸各自標(biāo)準(zhǔn)母液混合并稀釋10倍（標(biāo)樣取100μL，用流動(dòng)相定容到1mL），混標(biāo)2：馬來(lái)酸稀釋1000倍，其余各酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍（馬來(lái)酸取10μL，其余各酸取1mL，最后用流動(dòng)相定容到10mL）。

1．4 數(shù)據(jù)處理

本文的結(jié)果數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值，數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOA方差分析，并用LSD進(jìn)行多重比較。數(shù)據(jù)分析及圖表均在 Microsoft Excel 2003和 DPS 12．5軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2．1 不同紫云英基因型性狀及干物重差異

從表1可以看出，不同紫云英品種在土培條件下其株高、根長(zhǎng)及干物重的差異表現(xiàn)為：閩紫6號(hào)，閩紫7號(hào)和8487711之間株高差異不顯著，但這3個(gè)品種顯著高于閩紫1號(hào)，信陽(yáng)種，余江大葉和弋江籽；紫云英根部長(zhǎng)度9個(gè)品種間差異不顯著，可能由于生長(zhǎng)在小型容器范圍內(nèi)限制了根系的生長(zhǎng)。從紫云英地上部莖葉和地下根部干物質(zhì)看，閩紫7號(hào)顯著高于閩紫1號(hào)，但與其他幾個(gè)品種間未見(jiàn)顯著差異。然而在總干重方面（地上部和地下部干重總和），閩紫7號(hào)顯著大于閩紫1號(hào)，余江大葉和弋江籽。

2．2 不同紫云英基因型根系分泌草酸、蘋(píng)果酸濃度差異

從圖1和圖2可見(jiàn)，不同紫云英基因型分泌的草酸和蘋(píng)果酸濃度分別介于0．015～0．034mg／mL和0．001～0．031mg／mL之間。9個(gè)紫云英品種都可分泌草酸，且重復(fù)間穩(wěn)定變異系數(shù)不大；84341022（0．034mg／mL）分泌的草酸量最大，顯著高于閩紫1號(hào)、閩紫7號(hào)、8487711、浙紫5－12、余江大葉和弋江籽，但84341022與信陽(yáng)種和閩紫6號(hào)之間差異不顯著。在蘋(píng)果酸分泌方面，除弋江籽未檢測(cè)到，其余8個(gè)品種都有一定量蘋(píng)果酸分泌；閩紫1號(hào)蘋(píng)果酸分泌量低，僅為0．001mg／mL，閩紫7號(hào)分泌量最大達(dá)到0．031mg／mL；閩紫7號(hào)和浙紫5－12這2個(gè)品種蘋(píng)果酸分泌量顯著高于閩紫1號(hào)，但除閩紫1號(hào)外，其他品種間未見(jiàn)顯著差異，究其原因可能與重復(fù)間變動(dòng)差異大有關(guān)。

2．3 不同紫云英基因型根系分泌乳酸、乙酸濃度差異

從圖3可見(jiàn)，紫云英乳酸分泌量介于0．027～0．530mg／mL，閩紫7號(hào)和浙紫5－12乳酸分泌量大，分別為0．53和0．52mg／mL；但經(jīng)過(guò)方差分析表明，9個(gè)品種間乳酸分泌未見(jiàn)顯著差異，其原因是重復(fù)間變動(dòng)差異大所致。從圖4可以看出，乙酸分泌量為0．01～0．14mg／mL，閩紫1號(hào)和閩紫7號(hào)顯著高于閩紫6號(hào)、余江大葉、84341022和弋江籽，但閩紫1號(hào)、信陽(yáng)種、閩紫7號(hào)和8487711品種間乙酸分泌未見(jiàn)顯著差異。

表1 不同紫云英基因型性狀及干物重差異Table 1 Effect of genotypic character of different A．sinicus on dry weight

圖1 不同紫云英基因型草酸濃度差異Fig．1 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on oxalic acid

圖2 不同紫云英基因型蘋(píng)果酸濃度差異Fig．2 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on malic acid

圖3 不同紫云英基因型乳酸濃度差異Fig．3 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on lactic acid

圖4 不同紫云英基因型乙酸濃度差異Fig．4 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on macetic acid

2．4 不同紫云英基因型根系分泌檸檬酸、琥珀酸濃度差異

從圖5和圖6可見(jiàn)，不同紫云英基因型分泌的檸檬酸和琥珀酸酸濃度分別介于0．037～0．152mg／mL和0．005～0．314mg／mL之間。閩紫7號(hào)、84341022和浙紫5－12（這3個(gè)品種間無(wú)顯著差異）檸檬酸分泌量顯著高于閩紫1號(hào)、信陽(yáng)種、弋江籽和余江大葉。在琥珀酸分泌量方面，其濃度閩紫7號(hào)除與84341022相近外，都顯著高于其他各個(gè)品種；閩紫7號(hào)琥珀酸分泌量是余江大葉的62．8倍。

圖5 不同紫云英基因型檸檬酸濃度差異Fig．5 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on citric acid

圖6 不同紫云英基因型琥珀酸濃度差異Fig．6 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on suceinic acid

2．5 不同紫云英基因型根系分泌有機(jī)酸總量差異

圖7 不同紫云英基因型有機(jī)酸總量差異Fig．7 Effect of genotypic variation of different A．sinicus on total organic acid

有機(jī)酸總量為各個(gè)紫云英品種分泌的草酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸的總和。從圖7可以看出，土培條件下紫云英有機(jī)酸分泌總量介于0．075～1．181mg／mL；大體可以分為 3 類：8324411、浙紫5－12、8487711，84341022、余江大葉、閩紫1號(hào)、信陽(yáng)種、閩紫6號(hào)，弋江籽；閩紫7號(hào)總的有機(jī)酸最大，弋江籽有機(jī)酸總量最低，僅為0．075 mg／mL，閩紫7號(hào)有機(jī)酸總量是弋江籽的約15倍；此外，閩紫7號(hào)顯著高于閩紫1號(hào)、信陽(yáng)種、閩紫6號(hào)、余江大葉、84341022和弋江籽；但閩紫7號(hào)與8487711、浙紫5－12未見(jiàn)顯著差異。

2．6 不同紫云英基因型根系分泌各有機(jī)酸與生物量的關(guān)系

從圖8可以看出，紫云英分泌有機(jī)酸（草酸、蘋(píng)果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸）與植株生物量的相關(guān)擬合關(guān)系表明，紫云英根系分泌的草酸、乳酸、乙酸和檸檬酸與生物量擬合度較低，其對(duì)應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（r＜ɑ0．05），差異不顯著。然而，紫云英根系分泌的蘋(píng)果酸、琥珀酸與生物量擬合相關(guān)系數(shù)差異達(dá)到極顯著水平，呈極顯著正相關(guān)。因此，所分泌的蘋(píng)果酸和琥珀酸含量的高低可以一定程度上表征紫云英生物量高低，或者某種意義上說(shuō)明其對(duì)土壤中難溶性養(yǎng)分的釋放與溶解發(fā)揮著重要作用，所釋放與溶解的養(yǎng)分可供紫云英吸收利用，進(jìn)而影響紫云英生長(zhǎng)及生物量。

2．7 不同紫云英基因型根系分泌有機(jī)酸總量與生物量的關(guān)系

圖8 紫云英根系分泌各有機(jī)酸與植株生物量的關(guān)系Fig．8 Relationship between plant biomass and each organic acid

圖9 根系分泌有機(jī)酸總量與植株生物量的關(guān)系Fig．9 Relationship between plant biomass and total organic acid

從圖9可以看出，紫云英根系分泌的有機(jī)酸總量與生物量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，有機(jī)酸分泌的高低對(duì)紫云英植株生長(zhǎng)及生物量影響顯著。大量研究表明，有機(jī)酸對(duì)酸性土壤中 Al－P和 Fe－P中 Al3＋、Fe3＋的螯合有利，可使難溶性Al－P和Fe－P中的P釋放出來(lái)供植物吸收利用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，紫云英在土培條件下可分泌6種成分有機(jī)酸，當(dāng)然在實(shí)際條件下，所分泌的有機(jī)酸種類可能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于這些，在利用高效液相色譜測(cè)定時(shí)只選定常見(jiàn)成分9種有機(jī)酸（另外3種酸是甲酸、酒石酸和馬來(lái)酸）進(jìn)行標(biāo)定。土壤養(yǎng)分的高低對(duì)紫云英生物量影響很大，然而在同等土壤背景條件下，作物有機(jī)酸分泌量勢(shì)必很大程度上影響植物的生長(zhǎng)，它能充分與土壤中難溶性化合物中陽(yáng)離子進(jìn)行螯合反應(yīng)，促進(jìn)難溶性養(yǎng)分的溶解，釋放出有效養(yǎng)分供植物吸收利用。9個(gè)不同紫云英基因型中，分泌有機(jī)酸累積量最高的品種為閩紫7號(hào)，最低為弋江籽，其對(duì)應(yīng)的生物量閩紫7號(hào)也是最高，雖然弋江籽的生物量不是最低，但也接近最低。

3 討論

蘭忠明等［17］報(bào)道了用溶液培養(yǎng)法收集不同紫云英基因型根系分泌物，顯現(xiàn)出有機(jī)酸的差異性，主要成分是草酸；個(gè)別基因型還分泌出少量酒石酸、檸檬酸、蘋(píng)果酸、琥珀酸等［13］；通過(guò)石英砂培養(yǎng)試驗(yàn)，表明閩紫6號(hào)和閩紫1號(hào)在利用難溶性磷時(shí)都顯著高于余江大葉和弋江籽。不同紫云英基因型在不同磷源中，地上部、地下部吸磷量及總吸磷量也均表現(xiàn)為K－P＞Al－P＞Fe－P＞CK，紫云英對(duì)難溶性磷吸收利用時(shí)，對(duì)Al－P吸收富集優(yōu)于Fe－P［14］；然而，在土培條件下，所有基因型都檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的有機(jī)酸（除弋江籽和蘋(píng)果酸外），3個(gè)重復(fù)中都有2個(gè)或3個(gè)數(shù)值即重復(fù)效應(yīng)較好，但某些品種分泌的有機(jī)酸重復(fù)變異較大。溶液培養(yǎng)中在缺磷下，閩紫1號(hào)、閩紫6號(hào)兩種紫云英在草酸分泌方面顯著高于弋江籽和余江大葉，但在土培試驗(yàn)中閩紫6號(hào)和閩紫1號(hào)草酸濃度含量雖高于弋江籽和余江大葉，然而統(tǒng)計(jì)分析閩紫6號(hào)、閩紫1號(hào)、余江大葉和弋江籽草酸含量未達(dá)顯著差異，可能是由于在土培收集根系分泌物抖土過(guò)程中根系一定程度受到損傷，導(dǎo)致根系分泌的有機(jī)酸濃度降低（溶液培養(yǎng)在理想條件下，根系損傷少）。前期采用石英砂培養(yǎng)研究結(jié)果表明：閩紫6號(hào)對(duì)難溶性磷的吸收量及生物量均高于浙紫5－12、弋江籽和余江大葉，土培試驗(yàn)表明，閩紫6號(hào)的生物量都高于浙紫5－12、弋江籽和余江大葉，然而品種間未見(jiàn)顯著差異水平。田間磷高效試驗(yàn)結(jié)果表明，閩紫7號(hào)在大田栽培適應(yīng)性方面表現(xiàn)出磷高效特征，土培試驗(yàn)結(jié)果也表明閩紫7號(hào)有機(jī)酸分泌總量最大其生物量也最高，其結(jié)果與水培、砂培、土培和田間試驗(yàn)的結(jié)果一致。因此，可以得出，不同紫云英基因型根系分泌物有機(jī)酸不同，紫云英根系分泌的蘋(píng)果酸、琥珀酸與生物量擬合呈極顯著正相關(guān)，紫云英根系分泌的蘋(píng)果酸和琥珀酸含量高低可以一定程度上表征紫云英生物量高低。

［1］Jones D L．Organic acids in the rhizosphere－a critical review［J］．Plant and Soil，1998，205：25－44．

［2］Shen A L，Li X，Kanamori T，etal．Low－molecular－weight organic acids in two Japanese soils incubated with plant residues under different moisture conditions：I．Aliphatic acids［J］．Pedosphere，1997，7（1）：79－86．

［3］Strobel B W．Influence of vegetation on low－molecular－weight carboxylic acids in soil solution－A review［J］．Geoderma，2001，99：169－198．

［4］嚴(yán)小龍．根系生物學(xué)原理與應(yīng)用［M］．北京：科學(xué)出版社，2007：115－142．

［5］Gardner W K，Parbery D G，Barber D A．The acquisition of phosphorus byLupinusalbusL．I．Some characteristics of the soil／root interface［J］．Plant and Soil，1982，68（1）：19－32．

［6］Gardner W K，Parbery D G，Barber D A．The acquisition of phosphorus byLupinusalbusL．II．The effect of varying phosphorus supply and soil type on some characteristics of the soil／root interface［J］．Plant and Soil，1982，68（1）：33－41．

［7］Gardner W K，Barber D A，Parbery D G．The acquisition of phosphorus byLupinusalbusL．III．The probable mechanism by which phosphorus movement in the soil／root interface is enhanced［J］．Plant and Soil，1983，70（1）：107－124．

［8］谷俊濤，李金才，韓勝芳，等．異源表達(dá)白羽扇豆酸性磷酸酶基因?qū)Π兹~草磷吸收的影響［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（4）：69－75．

［9］Ae N，Arihara J，Okada K，etal．Phosphorus uptake by pigeon pea and its role in cropping systems of the Indian subcontinent［J］．Science，1990，248（49－54）：477－480．

［10］Subbarao G V，Ae N，Otani T．Genetic variation in acquisition and utilization of phosphorus from iron－bound phosphorus in pigeon pea［J］．Soil Science and Plant Nutrition，1997，43（3）：511－519．

［11］Gahoonia T S，Asmar F，Giese H，etal．Root－released organic acids and phosphorus uptake of two barley cultivars in laboratory and field experiments［J］．European Journal of Agronomy，2000，12（3／4）：281－289．

［12］Shen H，Yan X L，Zhao M，etal．Exudation of organic acids in common bean as related to mobilization of aluminum－and iron－bound phosphates［J］．Environmental and Experimental Botany，2002，48（1）：1－9．

［13］趙明，沈宏，嚴(yán)小龍．不同菜豆基因型根系對(duì)難溶性磷的活化吸收［J］．植物營(yíng)養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2002，8（4）：435－440．

［14］Johnson S E，Loeppert R H．Role of organic acids in phosphate mobilization from iron oside［J］．Soil Science Society of A－merica Journal，2006，70：222－234．

［15］Onthong J，Osaki M，Nilnood C，etal．Phosphorus status of some highly weathered soils in peninsulr Thailand and availability in relation to citrate and oxalate application［J］．Soil Science and Plant Nutrition，1999，45：627－637．

［16］師尚禮，曹致中，劉建榮．苜蓿根瘤菌溶磷和分泌植物生長(zhǎng)素能力研究［J］．草業(yè)學(xué)報(bào)，2007，16（2）：105－111．

［17］蘭忠明，林新堅(jiān)，張偉光，等．缺磷對(duì)紫云英根系分泌物產(chǎn)生及對(duì)難溶性磷活化的影響［J］．中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，45（8）：1521－11531．

［18］蘭忠明，張輝，吳一群，等．不同紫云英基因型對(duì)難溶性磷吸收利用的影響［J］．生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2011，20（10）：1454－1460．