侯吉倫，李 超，王桂興，張曉彥，孫朝徽，王玉芬，姜秀鳳，劉海金

（1.中國水產(chǎn)科學研究院北戴河中心實驗站，河北秦皇島066100；2.上海海洋大學，上海201306；3.中國水產(chǎn)科學研究院，北京 100141）

1 前言

在一般情況下，硬骨魚類排出體外的成熟卵子處于第二次減數(shù)分裂中期。魚類的這種繁殖特征為魚類的細胞工程育種，例如：多倍體誘導、雄核發(fā)育誘導以及雌核發(fā)育誘導。人工誘導雌核發(fā)育是一種快速固定母本性狀、生產(chǎn)單性化苗種以及建立純系的有效手段。根據(jù)原理的不同，人工誘導雌核發(fā)育又可進一步被分為減數(shù)分裂雌核發(fā)育（Meiogynogenesis）和有絲分裂雌核發(fā)育（M itogynogenesis）。減數(shù)分裂雌核發(fā)育比有絲分裂雌核發(fā)育更易操作，有更高的誘導率，目前已經(jīng)成功地應用于上百種魚類[1～3]。

牙鲆（Paralichthys olivaceus）是一種重要經(jīng)濟魚類，雌性個體生長速度明顯比雄性快。中國水產(chǎn)科學研究院北戴河中心實驗站運用雌核發(fā)育誘導技術(shù)，選育的全雌牙鲆新品種“北鲆1號”和“北鲆2號”，具有雌性比例高、生長快、規(guī)格整齊、容易飼養(yǎng)等特點。關(guān)于牙鲆雌核發(fā)育的研究，已經(jīng)有眾多論文報導[4～6]。王桂興等[7]采用微衛(wèi)星技術(shù)，研究了牙鲆連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的遺傳特征，結(jié)果顯示，第二代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的純合度、個體間平均相似度以及親子間的平均相似度要略高于第一代雌核發(fā)育家系，顯著高于對照家系。

本研究在王桂興等[7]技術(shù)的基礎上，對性成熟的第二代雌核發(fā)育個體再度誘導減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得三個連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系，并利用 30對微衛(wèi)星引物分析了該三個家系的純合度和遺傳相似度，旨在探討牙鲆連續(xù)多代雌核發(fā)育過程對等位基因純合進程的影響，為牙鲆通過連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育方法建立純系以及優(yōu)良品種選育提供相應的數(shù)據(jù)支持。

2 材料和方法

2.1 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的構(gòu)建

本實驗在中國水產(chǎn)科學研究院北戴河中心實驗站開展。2007年，以真鯛精子作為異源精子，經(jīng)紫外線照射滅活，激活一尾雌性野生牙鲆所產(chǎn)卵子，并在激活后3m in，施以3℃，45m in的冷休克處理進行減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導，獲得第一代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系（Meio-G1）。2009年，利用Meio-G1內(nèi)發(fā)育成熟的一尾個體再度誘導減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得連續(xù)第二代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系（Meio-G2）。2014年，以Meio-G2家系內(nèi)三尾性成熟個體進行減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導，獲得了三個連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系（Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3）。

2.2 樣品采集與基因組DNA提取

采集作為母本的三尾Meio-G2的腹面胸鰭和Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3家系仔魚各30尾，置于100%酒精中固定，-20℃保存。基因組DNA提取采用傳統(tǒng)的酚-氯仿抽提法進行[7]。

2.3 微衛(wèi)星引物

微衛(wèi)星引物全部選自Coimbra等[8]繪制的牙鲆第二代遺傳連鎖圖譜，根據(jù)劉永新等[9]的實驗結(jié)果，選取重組率高、中、低的引物各10對，所選引物覆蓋牙鲆24個連鎖群。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。引物序列、退火溫度、M-C距離和Genbank登錄號見表1。

表1 30對微衛(wèi)星標記位點引物序列、退火溫度、M-C距離和Genbank登錄號Table1 Primer sequences，annealing temperatures，M-C distance and accession number in Gen Bank of 30 microsatellite lociin the Paralichthys olivaceus

續(xù)表

2.4 聚合酶鏈式反應（PCR）擴增及電泳

PCR反應體系采用 15μL，包括：10×Buffer 2.5 μL、Mg2+（25 mmol/L）1 μL、dNTPs（2 mmol/L）1μL、上下游引物（10mmol/L）各0.6μL、DNA模板1 μL（40～50 ng）、Taq DNA 聚合酶 1 U，加適量ddH2O。反應程序為94℃預變性4m in；共25個循環(huán)包括94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸30 s；最后72℃延伸8m in，PCR擴增在PE9700型PCR儀上進行。PCR產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染顯色后用HPScanjetG4010掃描儀成像，用Gel-Pro Analyzer4.5凝膠分析軟件對電泳圖像進行數(shù)據(jù)采集和分析。

2.5 統(tǒng)計指標

等位基因數(shù)（number of alleles，A）、觀測雜合度（Ho）、純合度（homozygosity）、遺傳相似系數(shù)（genetic similarity index，GSI）等遺傳參數(shù)均由 popgene（ver.3.2）計算獲得。重組率和近交系數(shù)由以下公式計算

重組率r=雜合子數(shù)/個體總數(shù)

近交系數(shù)

式（1）中，F(xiàn)為第i世代的近交系數(shù)；Gi為第i代雌核發(fā)育家系；r為微衛(wèi)星位點的重組率。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR擴增及基因純合度

本研究選用的30對微衛(wèi)星引物在Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個家系中均能擴增出穩(wěn)定的PCR產(chǎn)物，所擴增到的等位基因數(shù)分別為35、38、37，平均等位基因數(shù)為1.17、1.27、1.23（見表2）。平均觀測雜合度（Ho）分別為0.146 7、0.255 6、0.205 6，平均純合度分別為0.853 3、0.744 4、0.794 4。t檢驗結(jié)果顯示，Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個家系間的平均觀測雜合度和平均純合度差異均不顯著（P＞0.05）。

表2 30個微衛(wèi)星座位上的等位基因數(shù)、觀測雜合度及純合度Table 2 Number of alleles，observed heterozy gosity and homo zygosity for the 30 microsatellite loci

3.2 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系內(nèi)個體間的遺傳相似度

根據(jù)所檢測的30個微衛(wèi)星位點的基因類型，分別計算了Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3家系內(nèi)個體間的遺傳相似度（見表3）。結(jié)果表明，連續(xù)三代雌核發(fā)育家系內(nèi)個體間平均遺傳相似度在0.983 8～0.991 8，顯示此群體已經(jīng)是一個遺傳一致性很高的品系。另外，各家系母本與子代之間的平均遺傳相似度要高于子代之間的相似度。

表3 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系內(nèi)的遺傳相似度Table3 Genetic similarity within family of the third successive meiogyno genetic generation

3.3 連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系間的遺傳相似度

根據(jù)30個微衛(wèi)星位點的基因型數(shù)據(jù)，計算了Meio-G3-1、Meio-G3-2、Meio-G3-3三個家系間的遺傳相似度（見表4）。三個家系間的遺傳相似度在0.971 4～0.981 0，遺傳距離在0.019 1～0.029 0。三個家系之間均表現(xiàn)出高度的遺傳相似性。

表4 三個連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離Table 4 Genetic similarity and genetic distance among three third-generation of successive meiogynogenetic families in Japanese flounder Paralichthy solivaceus

3.4 不同微衛(wèi)星位點的純合效率和近交系數(shù)

在三個家系中，30個微衛(wèi)星位點分別檢測出5個、8個和7個多態(tài)性位點，多態(tài)性位點百分比為16.67、26.67、23.33，其余的各個位點，母本檢測到的為單態(tài)，只有一個等位基因，子代在這些位點的純合性和母本相同，完全純合固定。近交系數(shù)是衡量微衛(wèi)星位點純合速率的一個指標，雜合位點在各家系的近交系數(shù)范圍為0～0.7（Meio-G3-1）、0～0.66（Meio-G3-2）、0～0.98（Meio-G3-3）。不同雜合位點在不同家系表現(xiàn)出不同的純合速率。比如，Poli1431TUF位點在Meio-G3-1和Meio-G3-2家系各觀測到10個和9個純合個體，而在Meio-G3-3家系中，只有兩個個體在此位點為純合；Poli1010TUF位點在Meio-G3-1家系中觀測到8個純合個體，而在Meio-G3-2和Meio-G3-3家系中卻沒有觀測到純合個體（見表5）。

表5 部分微衛(wèi)星位點上純合個體數(shù)量、比率、重組率和近交系數(shù)Table5 Number of homo zygote，recombination frequency，coefficient of inbreeding(F)of some detected microsatellite lociin the third successive meiogynogenetic generation offspring Paralichthys olivaceus

4 結(jié)語

本研究首次報道了牙鲆三個連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的建立，并通過30對微衛(wèi)星引物對這三個家系進行了遺傳特征的研究。結(jié)果表明，家系內(nèi)個體間和家系間都具有高度的遺傳相似性。本研究中只選取一尾親魚的卵子，通過人工誘導減數(shù)分裂雌核發(fā)育，獲得減數(shù)分裂雌核發(fā)育一代家系Meio-G1，再隨機選取Meio-G1內(nèi)一尾發(fā)育成熟雌性個體進行第二輪減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導，獲得第二代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系Meio-G2。待Meio-G2家系雌魚性成熟時，再隨機選取三尾分別進行第三輪減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導，從而建立了三個連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系。每一代都只選用單一母本分別進行減數(shù)分裂雌核發(fā)育的誘導，在最大程度上確保了遺傳背景的一致性和等位基因代際純化的最大化，從而獲得遺傳相似度高的家系。

遺傳一致性高的動物品系對動物實驗的可靠性以及可重復性具有重要意義。在生物學研究中，獲得的實驗結(jié)果包含了處理效應、所用生物的遺傳變異、非遺傳變異以及各因素之間的互作。一個好的實驗設計是要控制和減少這些變異，從而讓處理的信息更加清晰和可靠。獲得具有高統(tǒng)計效力實驗結(jié)果的最佳方法是利用不同近交系具有遺傳異質(zhì)性的少量個體進行實驗[10]。在動物中，建立近交系最常用的方法為全同胞交配法，運用此方法，建立一個近交系需要至少20代[11]。迄今為止，運用全同胞交配法，已經(jīng)建立了數(shù)百個嚙齒類的近交系[12]。在斑馬魚上，一個連續(xù)16代的全同胞交配品系也已經(jīng)被建立[13]。相比于傳統(tǒng)的全同胞交配法，人工誘導減數(shù)分裂雌核發(fā)育法具有快速固定母本性狀、提高等位基因純合速率等優(yōu)點。一般認為，一代雌核發(fā)育相當于8～10代的連續(xù)全同胞交配[14]。在牙鲆上，一代減數(shù)分裂雌核發(fā)育相當于9～10個世代的全同胞交配，連續(xù)第二代減數(shù)分裂相當于11～12代全同胞交配[7]。本研究中，三個家系內(nèi)子代間的平均遺傳相似度在0.981 3～0.991 8，家系間的平均遺傳相似度0.971 4～0.981 0。團頭魴（Megalobrama amblycephala）連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系內(nèi)個體間的平均遺傳相似度為0.984 5[15]，本研究結(jié)果與之相近。通過誘導連續(xù)三代雌核發(fā)育所獲得的個體，無論家系內(nèi)，還是家系間，都具有高度的遺傳相似性，接近或略高于連續(xù)20代全同胞交配所獲得的理論結(jié)果（0.986）。因此，連續(xù)誘導多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育能建立近交系，且比傳統(tǒng)的全同胞交配法更節(jié)省時間。

由于減數(shù)分裂過程中，存在著等位基因的重組，而且由于不同等位基因在染色體上的位置不同造成重組率的差異，導致了純合速率的差異，所以導致連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育雖能一定程度加速等位基因純化的進程，但很難獲得所有位點全部純合的個體。將連續(xù)多代減數(shù)分裂雌核發(fā)育個體再進行一次有絲分裂雌核發(fā)育的誘導，將能獲得雙單倍體純合子。在牙鲆上，純合度高的個體比純合度低的個體具有更高的有絲分裂雌核發(fā)育誘導成功率。

綜上所述，通過連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育誘導所獲得的牙鲆，具有高度的純合性和遺傳相似度，是進行牙鲆良種選育（quantitative trait locus）、QTL定位及其他遺傳學研究的優(yōu)質(zhì)材料。

[1] Arai K.Genetic improvement of aquaculture finfish species by chromosome manipulation techniques in Japan[J].Aquaculture，2001，197：205-228.

[2] Peruzzi S，Chatain B.Pressure and cold shock induction of meiotic gynogenesis and triploidy in the European sea bass，Dicentrarchus labraxL.：Relative efficiency of methods and parental variability[J].Aquaculture，2000，189：23-37.

[3] You C，Yu X，Tan D，et al.Gynogenesis and sex determination in large-scale loachParamisgurnus dabryanus(Sauvage)[J].Aquaculture International，2008，16：203-214.

[4] Yamamoto E.Studies on sex-manipulation and production of cloned populations in Hirame flounder，Paralichthys olivaceus(Temminck et Schlegel)[J].Bulletin of Tottori Prefecture Fishery Experiment Station，1995，34：1-145.

[5] 劉海金，侯吉倫，常玉梅，等.真鯛精子誘導牙鲆減數(shù)分裂雌核發(fā)育[J].水產(chǎn)學報，2010，34(4)：508-514.

[6] Tabata K，Gorie S，Nakamura K.Studies on the gynogenesis in hirameParalichthys olivaceus.II induction of gynogenetic diploid in hirameParalichthys olivaceus[J].Nippon Suisan Gakkaishi，1986，52(11)：1901-1904.

[7] 王桂興，劉海金，張曉彥，等.牙鲆連續(xù)兩代減數(shù)分裂雌核發(fā)育家系的遺傳特征[J].中國水產(chǎn)科學，2012，19(3)：381-389.

[8] Coimbra M R，KobayashiK，Koretsugu S，etal.AGenetic linkage map of the Japanese flounder，Paralichthys olivaceus[J].Aquaculture，2003，220(1-4)：203-218.

[9] 劉永新，朱以美，劉英杰，等.牙鲆渤海自然群體的遺傳多樣性分析[J].水產(chǎn)學報，2013，37(11)：1609-1617.

[10] Festing M FW.The Design and statistical analysis of animal experiments[J].ILAR Journal，2002，43(4)：191-193.

[11] Casellas J.Inbred mouse strains and genetic stability：A review[J].Animal，2011，5(1)：1-7.

[12] Grimholt U，Johansen R，Sm ith A.A review of the need and possible uses for genetically standardized Atlantic salmon(Salmo salar)in research[J].Laboratory Animals，2009，43(2)：121-126.

[13] Shinya M，Sakai N.Generation of highly homogeneous strains of zebrafish through full sib-pair mating[J].G3(Bethesda)，2011，1(5)：377-386.

[14] 劉靜霞，周 莉，趙振山，等.錦鯉4個人工雌核發(fā)育家系的微衛(wèi)星標記研究[J].動物學研究，2002，23(2)：97-105.

[15] 唐守杰，李思發(fā)，蔡完其.團頭魴連續(xù)三代減數(shù)分裂雌核發(fā)育群體遺傳變異的微衛(wèi)星分析[J].淡水漁業(yè)，2014，44(2)：3-8.