竇雅靜，康麗華，陸俊錕，侯俊杰，朱亞杰

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；2.三亞林場，海南 三亞 570000）

黑木相思根瘤菌ACC脫氨酶活性的研究

竇雅靜1,2，康麗華1，陸俊錕1，侯俊杰1，朱亞杰1

（1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 熱帶林業(yè)研究所，廣東 廣州 510520；2.三亞林場，海南 三亞 570000）

根瘤菌能夠利用1-氨基環(huán)丙烷-1羧酸（ACC）脫氨酶催化ACC 脫氨基，從而降低植物體內(nèi)抑制其生長的乙烯含量，促進(jìn)植物生長。本研究采用茚三酮比色法測定菌株的ACC 脫氨酶活性并對其acdS 基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，擴(kuò)增174 株供試菌株中，151 株檢測出ACC 脫氨酶活性，但酶活性差異較大。121株擴(kuò)增出acdS 基因，菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與地理來源具有相關(guān)性，中慢生根瘤菌屬菌株的acdS 基因具有明顯的保守性。菌株ACC 脫氨酶活性的高低與acdS 基因存在與否的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。ACC 脫氨酶活性的檢測方法將為快速篩選高效根瘤菌菌株提供可靠的理論依據(jù)。

黑木相思；根瘤菌；ACC脫氨酶活性；acdS基因

植物在受到干旱、洪澇、高低溫、鹽堿及重金屬等逆境脅迫和病原微生物侵染時會應(yīng)激產(chǎn)生大量植物激素乙烯，高濃度的乙烯會抑制植物的生長和發(fā)育[1]。1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫 氨 酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase，簡稱ACC 脫氨酶）是一種能夠抑制植物體內(nèi)乙烯合成的胞內(nèi)聚合酶，該酶能將乙烯合成前體ACC 分解為α-酮丁酸和氨[2]。ACC 脫氨酶是細(xì)菌促進(jìn)植物生長的一種重要特性，能夠增強(qiáng)植物的抗鹽脅迫、抗干旱脅迫、抗重金屬污染、抗有害微生物侵染等能力[3]。能夠表達(dá)ACC脫氨酶基因的根瘤菌的結(jié)瘤能力及其豆科宿主的耐受性都比較高[4]。篩選具有ACC 脫氨酶活性的菌株對根瘤菌菌劑的田間應(yīng)用具有重要的應(yīng)用意義。

黑木相思Acacia melanoxylonR. Br.是近年來我國南方引種的主要用材樹種之一。其木材是優(yōu)質(zhì)的貼面板原料，具有很高的經(jīng)濟(jì)價值。目前在我國黑木相思原木銷售價是每立方米3000 元以上，而且價格有不斷上升趨勢[5]。隨著市場需求增大，黑木相思在華南地區(qū)的種植面積逐漸擴(kuò)大，但黑木相思相比馬占相思Acacia mangium、厚莢相思Acacia crassicarpa等相思樹種生長較為緩慢。因此，生產(chǎn)上亟需接種根瘤菌來提高黑木相思的生長速度、苗木存活率。

Uchiumi 等[6]發(fā)現(xiàn)有些根瘤菌含有ACC 脫氨酶，它們的ACC 脫氨酶結(jié)構(gòu)基因（acdS）在根瘤中的表達(dá)量很高，敲除acdS基因后，根瘤菌的結(jié)瘤能力會顯著降低；相反地，Ma等[7]將acdS 基因?qū)氲皆緵]有ACC 脫氨酶的根瘤菌中，根瘤菌工程菌的結(jié)瘤率、占瘤率和固氮效率顯著高于野生型菌株。ACC 脫氨酶檢測通常采用2，4-二硝基苯肼比色法。有些根瘤菌具有acdS 基因[8]，但在自生狀態(tài)下不表達(dá)，只有在與豆科植物共生的根瘤中才能表達(dá)[9]。因此，安千里等[10]設(shè)計了擴(kuò)增acdS 基因的兩對光譜且特異性的引物acdSf3/acdSr3 和acdSf3/acdSr4，從分子水平檢測細(xì)菌是否有acdS 基因，這樣就排除了根瘤菌的acdS 基因在再自生狀態(tài)不表達(dá)的干擾，實現(xiàn)了具有ACC脫氨酶活性菌株的快速篩選。

本研究采用茚三酮比色法測定菌株的ACC 脫氨酶活性并對其acdS 基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。為快速篩選高效根瘤菌菌株，制作根瘤菌菌劑應(yīng)用于田間生產(chǎn)提供可靠的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 黑木相思根瘤菌的采集、分離和純化

采集：黑木相思根瘤從廣東、福建、江西各省8 個市縣15 個不同采樣點(diǎn)采集，采集到的根瘤放入硅膠干燥管中，帶回實驗室進(jìn)行分離和純化。

分離：將采集到的根瘤用水沖洗干凈，并在1.5 mL離心管中泡脹；將水倒掉，加入95%乙醇浸泡1 min；倒掉乙醇，加入0.2%升汞消毒1～3 min；倒掉升汞，用無菌水沖洗根瘤；最后一次沖洗后留少許無菌水在離心管中，搗碎根瘤制成菌懸液，沾取菌懸液在YMA平板上劃線，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

純化：挑取YMA平板上形態(tài)像根瘤菌的單菌落再純化，重復(fù)劃線1～2次，直至整個平板的菌落形態(tài)和大小一致，挑取單菌落接入YMA斜面中，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 ACC 脫氨酶結(jié)構(gòu)基因（acdS）擴(kuò)增

1.2.1 acdS 基因擴(kuò)增引物

acdS基因 PCR 擴(kuò)增引物參見文獻(xiàn)[10]。

1.2.2 acdS 基因擴(kuò)增反應(yīng)體系（25 μL）

體系組成見表1。

表1 acdS 基因擴(kuò)增反應(yīng)體系Table 1 Amplification reaction system of acdS gene

1.2.3 acdS 基因擴(kuò)增反應(yīng)條件

預(yù)變性95 ℃，4 min；35×（變性95 ℃ ，45 s；退火53 ℃，45 s；延伸72 ℃，1 min）；延伸72 ℃，10 min。

1.2.4 PCR 產(chǎn)物的檢測及序列分析

將 1 μL10×loading buffer 與 5 μL PCR 產(chǎn) 物充分混合，1% 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，150 V，30 min。電泳結(jié)束后，用紫外凝膠成像分析系統(tǒng)掃描照相，檢測擴(kuò)增片段長度與濃度。檢測正確的PCR 產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

將測得的acdS 基因序列提交到GenBank 數(shù)據(jù)庫中，使用NCBI 中的BlAST 軟件在線比對，并從GenBank 數(shù)據(jù)庫中下載與待分析序列相近序列。用MEGA 5.1 軟件分別對測得的各菌株acdS 基因進(jìn)行比對，用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap為1 000。

1.3 ACC 脫氨酶活性測定

本研究采用2，4-二硝基苯肼比色法檢測根瘤菌ACC 脫氨酶活性，參見文獻(xiàn)[11]。

細(xì)菌ACC 脫氨酶的活性計算公式如下：

ACC 脫 氨 酶 活 性 (m·mol)/(mg·h)= 生 成 的 α-酮丁酸的含量/（細(xì)菌蛋白含量×0.25 h）

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木相思根瘤菌的采集、分離和純化

從廣東、福建、江西各省8 個市縣15 個不同采樣點(diǎn)共分離到174株黑木相思根瘤菌，如表2所示。

2.2 ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因擴(kuò)增結(jié)果

本實驗對174 株供試菌株的ACC 脫氨酶結(jié)構(gòu)基因acdS 基因進(jìn)行了擴(kuò)增。先用引物acdSf3/r3進(jìn)行擴(kuò)增，共有121 株供試菌株擴(kuò)增出acdS基因，片段大小為680 bp；將未擴(kuò)增出acdS基因的菌株再用另一對引物acdSf3/r4進(jìn)行擴(kuò)增，共有8 株菌擴(kuò)增出acdS 基因，片段大小為760 bp。用MEGA 5.1 軟件采用鄰接法構(gòu)建聚類分析圖，如圖1所示。

表2 供試菌株Table 2 Tested strains

續(xù)表2The contiouation of table 2

續(xù)表2The contiouation of table 2

續(xù)表2The contiouation of table 2

174 株供試菌株中，132 株屬于慢生根瘤菌屬，擴(kuò)增出acdS 基因的有96 株，占慢生根瘤菌屬83%；中慢生根瘤菌有20 株，全部擴(kuò)增出；根瘤菌屬12 株，全未擴(kuò)增出acdS 基因；伯克霍爾德菌屬1株，未擴(kuò)增出acdS 基因；草螺菌屬9 株，其中5 株擴(kuò)增出acdS 基因，但由于菌株RITF1201、RITF1202、RITF1205、RITF1207 的acdS 基因片段只有200 bp，未加入到聚類分析中。

大部分供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與地理來源具有相關(guān)性，同一地理來源的菌株聚為一群。中慢生根瘤菌屬除菌株RITF1564 外，不同地理來源、不同種的菌株均聚為一類，說明中慢生根瘤菌屬的acdS 基因很保守，是通過水平轉(zhuǎn)移的方式傳遞的，這與Francisco 等[8]的研究結(jié)果相一致。

2.3 ACC 脫氨酶活性測定

174 株供試菌株中，151 株檢測出ACC脫氨酶活性，但酶活性差異較大，從75～36 652 nmol/(mg·h)（見表1）。文獻(xiàn)顯示，ACC 脫氨酶活性不低于20 nmol /(mg·h) 時，就可促進(jìn)植物生長[7]。本研究表明，ACC 脫氨酶活性低于600 nmol/(mg·h) 的菌株，不能擴(kuò)增出acdS 基因。

ACC 脫氨酶活性測定結(jié)果與asdS基因擴(kuò)增結(jié)果基本一致。部分菌株ACC脫氨酶活性較高，但也未擴(kuò)增出acdS 基因，其中RITF1462、RITF1464、RITF1471 屬于根瘤菌屬，結(jié)構(gòu)基因位于質(zhì)粒上，而根瘤菌屬菌株質(zhì)粒極易丟失[12]；伯克霍爾德屬菌株RITF14113 未擴(kuò)增出acdS 基因，可能是由于引物不適合。

3 結(jié)論與討論

本研究采用茚三酮比色法測定菌株的ACC 脫氨酶活性并對其acdS 基因進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析。174 株供試菌株中，121 株供試菌株擴(kuò)增出acdS基因，大部分供試菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與地理來源具有相關(guān)性，同一地理來源的菌株聚為一群，而中慢生根瘤菌屬菌株的acdS基因尤為保守。151株檢測出ACC 脫氨酶活性，但酶活性差異較大，所有擴(kuò)增出acdS 基因的菌株都具有ACC 脫氨酶活性，部分程度上支持了安千里[10]等的研究結(jié)果，但是具有acdS 基因的不同菌株的ACC 脫氨酶活性差異很大，從75～36 652 nmol/(mg·h)；另外少數(shù)菌株雖具有ACC 脫氨酶活性，但未擴(kuò)增出acdS 基因，推測是由于質(zhì)粒丟失造成的。這兩種情況說明，只利用基因擴(kuò)增的方法來篩選高效固氮菌株，很難區(qū)分菌株ACC 脫氨酶活性的高低，進(jìn)而難以判斷菌株共生固氮能力的強(qiáng)弱，而不具acdS 基因的菌株也可能具有很高的ACC 脫氨酶活性，容易漏篩。因此，可先測定菌株的ACC 脫氨酶活性，再對無活性的菌株的acdS 基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就可從大量供試菌株中無遺漏的篩選出高效菌株。ACC 脫氨酶活性與固氮能力和苗木生長狀況的相關(guān)性也有待進(jìn)一步研究。

菌株ACC 脫氨酶活性的高低與acdS 基因存在與否的相關(guān)有待進(jìn)一步研究。需通過苗木接種實驗，進(jìn)一步研究根瘤菌ACC 脫氨酶活性與固氮效率及苗木生長的相關(guān)性。

[1] 姚軍朋,姚 拓,王小利.ACC 脫氨酶的應(yīng)用研究進(jìn)展與評述[J].生物技術(shù),2010,20(2): 87-91.

[2] B. R. Glick, B. Todorovic, J. Czarny,et al. Promotion of plant growth by bacterial ACC deaminase[J]. Critical Reviews in Plant Sciences,2007,26(5-6):227-242.

[3] B. R. Glick, Z. Cheng, J. Czarny,et al.Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria[J].New Perspectives and Approaches in Plant Growth-Promoting Rhizobacteria Research,2007:329-339.

[4] F X Nascimento, C Brigido, B R Glick,et al.Mesorhizobium ciceri LMS-1 expressing an exogenous 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase increases its nodulation abilities and chickpea plant resistance to soil constraints[J].Letters in Applied Microbiology, 2012,55(1):15-21.

[5] 楊木新.黑木相思的經(jīng)濟(jì)價值及速生豐產(chǎn)栽培技術(shù)[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012,(9):226-227.

[6] T Uchiumi, T Ohwada, M Itakura,et al. Expression islands clustered on the symbiosis island of theMesorhizobium lotigenome[J]. Journal of Bacteriology,2004,186(8):2439-2448.

[7] W Ma, T C Charles, B R Glick. Expression of an exogenous 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase gene in Sinorhizobium meliloti increases its ability to nodulate alfalfa[J].Applied Environmental Microbiology,2004,70(10):5891-5897.

[8] F X Nascimento, C Brígido, B R Glick,et al.ACC deaminase genes are conserved among Mesorhizobium species able to nodulate the same host plant[J].FEMS microbiology letters,2012,336(1):26-37.

[9] W Ma, S B Sebestianova, J Sebestian,et al.Prevalence of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase inRhizobiumspp.[J]. Antonie Van Leeuwenhoek,2003,83(3):285-291.

[10] 浙江大學(xué), 武漢凱迪工程技術(shù)研究總院有限公司. 用于鑒定ACC脫氨酶結(jié)構(gòu)基因的引物及方法[P].中國專利:CN102534034A, 2012-07-04.

[11] Z Li, S Chang, L Lin,et al. A colorimetric assay of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) based on ninhydrin reaction for rapid screening of bacteria containing ACC deaminase[J]. Letters in applied microbiology,2011,53(2): 178-185.

[12] 譚洪花,曹尚銀,房經(jīng)貴,等.棗果實中苯丙氨酸解氨酶基因的克隆及序列分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2011,29(1):15-20.

[13] 許 雷,劉一星,方連玉.大青楊纖維素合酶PuCesA 6全長基因的獲得及分析[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2011,29(2):54-59.

[14] 肖澤鑫,彭劍華,詹潮安,等.主成分分析在臺灣相思優(yōu)樹選擇標(biāo)準(zhǔn)和方法中的應(yīng)用研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2012, 32(5):54-58.

[15] 沙樺欣,伍建榕,周利平,等.干熱河谷臺灣相思樹種根瘤菌的耐干熱研究[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報,2013,33(8):63-67,73.

[16] 陳文新.中國根瘤菌[M].北京:科學(xué)出版社,2011,81-331.

ACC deaminase activity of rhizobia associated withAcacia melanoxylon

DOU Ya-jing1,2, KANG Li-hua1, LU Jun-kun1, HOU Jun-jie1, ZHU Ya-jie1
(1. Research Institute of Tropical Forestry, Chinese Academy of Forestry, Guangzhou 510520, Guangdong, China;2. Sanya Forest Farm, Sanya 570000, Hainan, China)

Rhizobia can catalyze the ACC deaminase by using -aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) deaminase, thereby reducing the ethylene content in the plants that inhibits the growth of rhizobia and promoting plant growth. The tested bacterial strains were mensurated and theiracdS gene’s phylogenetic development were analyzed. The results show that among the isolated 174 isolates, 151 strains showed ACC deaminase activity, but there were rather differences in enzyme activity; however, the acdS gene of 121 strains were detected which were conserved inMesorhizobiumgenus; the phylogeny of acdS genes was signif i cantly correlated with geographical origin. A further research on the correlation between the level of ACC deaminase activity and the prevalence ofacdS genes is urgently needed. The test method of ACC deaminase will provide a reliable theoretical foundation for rapidly culling high eff i cient rhizobia strains.

Acacia melanoxylon; rhizobia; ACC deaminase activity; acdS gene

S718.43

A

1673-923X(2014)11-0077-07

2014-01-12

農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化資金項目”相思根瘤菌肥料關(guān)鍵技術(shù)轉(zhuǎn)化及產(chǎn)品示范”（2011GB24320016）；國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費(fèi)項目“功能微生物在低碳林業(yè)中的應(yīng)用研究”（201004075）

竇雅靜（1987-），女，河北玉田人，碩士研究生，主要從事黑木相思根瘤菌方面的研究；E-mail：malibeier0315@126.com

康麗華（1955-），女，研究員，從事應(yīng)用微生物方面的研究；E-mail：klh587@126.com

[本文編校：吳 毅]