【摘要】脫氫酶（dehydrogenase是一類催化物質氧化還原反應的酶，是已知酶中種類最多的一類，具有極其重要的生理學意義。本文介紹了其基本的相關概念，并對其制備、純化、活性檢測方法及在藥物篩選中的應用進行了總結，以便為其進一步研究提供參考。

【關鍵詞】脫氫酶：制備：純化：活性檢測：藥物篩選

doi：10.3969j.issn.1004-7484（x.2013.10.654文章編號：1004-7484（2013-10-6104-02

生物體內的化學反應稱為新陳代謝，簡稱代謝。生命的特征之一是不斷地進行新陳代謝，包括物質代謝和能量代謝。雖然生物體內的代謝條件十分溫和，但所有代謝都進行得極為順利和迅速，因為它們幾乎都是在生物催化劑（biocatalyst的催化作用下進行的。迄今為止，人們已經發(fā)現(xiàn)了兩類生物催化劑：酶與核酶。酶（enzyme是由活細胞合成的、具有催化作用的蛋白質。核酶（ribozyme是由活細胞合成的、具有催化作用的核酸。

根據(jù)酶促反應的性質可將酶分為六大類：氧化還原酶類、轉移酶類、水解酶類、裂解酶類、異構酶類和合成酶類。其中，氧化還原酶類是催化氧化還原反應的酶，又可分為氧化酶和脫氫酶兩類。^[1]脫氫酶類即需要輔酶Ⅰ（NA+或輔酶Ⅱ（NAP+作為受氫體，催化底物氫化脫氫反應的酶。

AH2+NA（P+A+NA（PH+H+

脫氫酶（dehydrogenase是廣泛存在于生物體內的一類代謝關鍵酶，在生物體內的氧化產能、解毒等生理活動中^[1]起重要作用，是已知酶中種類最多的一類。如糖代謝過程中的3-磷酸甘油醛脫氫酶、乳酸脫氫酶（糖酵解途徑^[2]，丙酮酸脫氫酶、二氫硫辛酸脫氫酶、異檸檬酸脫氫酶、α-酮戊二酸脫氫酶、琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶（有氧氧化途徑，6-磷酸葡萄糖脫氫酶（磷酸戊糖途徑等；脂肪代謝過程中的3-磷酸甘油脫氫酶、脂酰CoA脫氫酶、β-羥脂酰CoA脫氫酶、β-羥丁酸脫氫酶等；氨基酸代謝過程中的L-谷氨酸脫氫酶以及酒精代謝過程中的乙醇脫氫酶、乙醛脫氫酶等。^[1]目前，國內外不少學者對其進行了相關研究，本文將對其制備純化、活性檢測方法及在藥物篩選中的應用進行介紹。

1脫氫酶的制備純化

現(xiàn)在采用的純化方法都是以脫氫酶與雜蛋白在理化性質和穩(wěn)定性上的差別以及脫氫酶的生物學特性為依據(jù)。^[3]①溶解度不同：有機溶劑沉淀法、鹽析法、共沉淀法、選擇性沉淀法、等電點沉淀法及雙水相分離法。②根據(jù)酶和底物、輔助因子以及抑制劑間具有專一親和作用特點的親和分離法等。③根據(jù)電學性質、解離性質：吸附層析法、離子交換層析法、電泳法及聚焦層析法等。④根據(jù)分子大小的差別：凝膠過濾層析法、超濾法及超離心法等。⑤按穩(wěn)定性不同：酸堿變性、法熱變性法、表面活性劑變性法等。通常先運用非特異、低分辨率的操作單元，如沉淀、超濾和吸附等，這一階段的主要目的是盡快縮小樣品體積，提高產物濃度，除去最主要的雜質；然后是高分辨率的操作單元，如具有高效選擇性的離子交換色譜和親和層析，而將凝膠過濾層析這類分離規(guī)模小、分離速度慢的單元放在最后。

武愛民等^[4]采用弱陰離子樹脂EAE-52和藍色瓊脂糖凝膠FF層析對枯草芽孢桿菌產生的胞外二氫硫辛酰胺脫氫酶的粗酶液進行2步純化，得到電泳純的二氫硫辛酰胺脫氫酶，純化倍數(shù)為59.7，收率為46.9%。

夏玉鳳等^[5]以玉米黃化苗為生物材料，將其搗碎后，通過差速離心獲得線粒體，使用超聲波將其破碎，用2%TritonX-100溶膜，超速離心，硫酸銨沉淀，EAE-C32層析純化琥珀酸脫氫酶，純化倍數(shù)為12倍。電泳圖譜顯示一條帶。

李洪山等^[6]采用差速離心法、硫酸銨分級沉淀，EAE纖維素和半瓊脂糖柱層析方法，從早生植物梭梭體內分離出純化104倍的蘋果酸脫氫酶。龔韌等^[7]以豬心肌為原料，采用組織破碎、二度硫酸銨鹽析、EAE Sepharose F.F.離子交換層析、Phenyl Sepharose 6F.F.疏水層析及Sephadex G-75 Fine凝膠過濾等方法進行分離純化，蘋果酸脫氫酶比酶活達1212.97Umg，純化倍數(shù)達122.64倍，酶活力收率為53.64%。

asayoshi T^[8]等用含1%Triton X-100的緩沖液從F.saccharophilum的膜蛋白提取，先用陰離子交換柱EAE-Sephrose CL-6B和陽離子交換柱C-Sephrose CL-6B分離，再用Sephacryl S-300凝膠過濾層析，得到了純化倍數(shù)為277的純葡萄糖3-脫氫酶，收率達到32%。

6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶（6-PGAase在自然界中分布很廣，據(jù)文獻報道，已從植物、哺乳動物肝臟等中純化出6-PGAase^[9]。莫宏春等^[10]將枯草芽孢桿菌通過超聲破壁，（NH42SO4分段鹽析，EAE-Sepharose FF離子交換層析，Blue-Sepharose CL-6B親和層析，Sephadex G-200凝膠過濾等純化步驟，分離出6-磷酸葡萄糖脫氫酶。

谷氨酸脫氫酶（glutamate dehydrogenase，GH是生物體內谷氨酸生物合成的一種重要酶，自20世紀60年代以來已經有不同來源的GH得到分離純化和研究。^[11]朱鴻等^[12]以鴨肝為原料，采用丙酮脫脂、重金屬離子沉淀、硫酸銨分級沉淀、EAE-Sepharose離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠層析方法，分離純化得到谷氨酸脫氫酶。

乙醇脫氫酶（AH能夠催化乙醇氧化生成乙醛。.C.adhusudhan等^[13]采用硫酸銨及雙水相法共同沉淀蛋白質來純化AH。N.A.Willoughby等^[14]采用膨脹床金屬親和層析來純化AH。Chuanul hidayat等^[15]使用染料—亞氨基二酸做配體，純化AH。

2脫氫酶的活性檢測

脫氫酶由活的生物體所產生，是一種氧化還原酶，在生物細胞內催化有機物氧化脫氫，并將其傳遞給最終受氫體。它能夠催化氫從被氧化的物體（基質AH上轉移到另一個物體（受氫體B上：AH+B→A+BH，即酶促有機物質脫氫的作用。因此，脫氫酶活性可以通過加入人工受氫體，采用分光光度法、熒光法、同位素法和電化學法等測定方法進行檢測。

通常用于檢測脫氫酶活性的人工受氫體包括TTC（2，3，5-氯化三苯基四氮唑^[16]、刃天青^[17]以及INT（碘硝基四唑紫^[18]等，其中研究和應用最廣的是TTC。

姚莉麗等^[19]采用可見分光光度法（利用2，4-二硝基苯肼和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯腙，在堿性溶液中呈棕色，最大吸收波長為520nm檢測了乳酸脫氫酶的活性。

陳立華等^[20]采用紫外分光光度法測定了紅細胞葡萄糖-6-磷酸脫氫酶活性。紫外分光光度法測定G-6-P酶活性，采用測定NAPH生成量的吸光度變化量來反映酶活性高低，是一種酶活性的動力學檢測方法，故可對G-6-P活性定量測定。

曹偉峰等^[21]用定量熒光法檢測新生兒篩查濾紙干血斑標本葡萄糖-6-磷酸脫氫酶G6P活性。

陳麗麗等^[22]應用PCR技術擴增出了納豆芽孢桿菌谷氨酸脫氫酶編碼基因，構建表達載體對其進行體外表達，并采用分光光度法對表達的蛋白谷氨酸脫氫酶酶活性進行了分析。

3脫氫酶在藥物篩選中的應用

在當代藥物開發(fā)過程中，發(fā)現(xiàn)和選擇合適的藥物靶點是藥物開的第一步，也是藥物篩選及藥物定向合成的關鍵因素之一。^[23]而酶是一類重要的藥物靶點。

隨著細胞及分子生物學的發(fā)展，新技術方法越來越多地用于新靶點建立和藥物篩選研究，高通量篩選是20世紀80年代后期形成的尋找新藥的高新技術，是以藥物作用靶點為主要對象的細胞和分子水平的篩選模型，作為一種高度集成化的分析方式，芯片技術在藥物的高通量篩選中具有巨大的優(yōu)勢，如酶芯片，其理論基礎之一便是對酶活性的影響，如在以酶抑制劑為篩選目標篩選時，可采用酶活性作為指標，說明藥物的作用，^[24]可將酶芯片應用于酶抑制作用的篩選。

脫氫酶作為種類最多的一類代謝關鍵酶，雖然其在藥物篩選方面仍處于起步階段，但隨著各種脫氫酶與疾病密切關系的闡明，在不遠的未來，其一定會成為藥物發(fā)現(xiàn)中的重要武器。

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