【摘 要】本文采用龍桂開(kāi)浸銀法對(duì)克氏原螯蝦（Procambarus clarki）腸道嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和分布密度規(guī)律進(jìn)行了觀察，結(jié)果顯示：嗜銀細(xì)胞在腸道各段均有分布，分布密度以前腸最多、中腸其次、后腸最少；嗜銀細(xì)胞在腸道成群分布，大多數(shù)嗜銀細(xì)胞呈圓形、卵圓形，也有些呈長(zhǎng)條形、紡錘形、長(zhǎng)頸瓶形、三角形、梨形等形態(tài)；克氏原螯蝦腸道的組織化學(xué)反應(yīng)可能與其食性和消化特性有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】克氏原螯蝦；龍桂開(kāi)浸銀法；腸道；嗜銀細(xì)胞

克氏原螯蝦，又名克氏螯蝦、紅色沼澤螯蝦或淡水龍蝦，隸屬甲殼綱、軟甲亞綱、十足目、螯蝦科 [1]，原產(chǎn)于美國(guó)南部和墨西哥北部，后由日本傳入中國(guó)?？耸显r因其食性雜、生長(zhǎng)快、繁殖和抗病能力強(qiáng)而種群發(fā)展迅速，廣泛分布在全國(guó)各地的湖泊、江河、池塘、溝渠、沼澤和稻田中，已成為重要的經(jīng)濟(jì)水生動(dòng)物，并已經(jīng)取得大規(guī)模人工養(yǎng)殖的成功。

國(guó)內(nèi)對(duì)克氏原螯蝦的研究主要涉及其幼體發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)成分及其他一些生物學(xué)方面的內(nèi)容[2，3]，對(duì)其腸道的基礎(chǔ)研究很薄弱。龍桂開(kāi)浸銀法是使用較廣且能比較全面地反映消化道內(nèi)分泌細(xì)胞總量的一種染色方法[4]。在動(dòng)物的進(jìn)化過(guò)程中，腸道嗜銀細(xì)胞起源較早，廣泛存在于各類(lèi)脊椎動(dòng)物的消化道中[5，6]，但在無(wú)脊椎動(dòng)物中報(bào)道較少，尚未見(jiàn)關(guān)于克氏原螯蝦的報(bào)道。通過(guò)對(duì)其消化道嗜銀細(xì)胞的分布及形態(tài)特點(diǎn)的試驗(yàn)，可進(jìn)一步豐富比較內(nèi)分泌學(xué)資料，更能比較多地了解克氏原螯蝦腸道的組織化學(xué)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用克氏原螯蝦于2013年7月由南陵縣煙墩水產(chǎn)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社提供，共8只，平均體重為24g，平均全長(zhǎng)為10cm。

1.2 取材

將8只克氏原螯蝦取出，用電子秤稱(chēng)重（±0.001g），用直尺測(cè)量全長(zhǎng)（±0.1cm），并記錄?；铙w解剖，用鑷子將腸道從內(nèi)臟中分離出來(lái)，并清除表面的脂肪和肝胰臟組織，然后用鑷子將腸道內(nèi)的水分和食物顆粒碾出，剪取前腸、中腸和后腸各2段。

1.3 龍桂開(kāi)浸銀法

（1）取材：清洗出3支干凈的容器（如廢棄的青霉素瓶子），并標(biāo)上標(biāo)簽（前腸、中腸、后腸），將對(duì)應(yīng)的組織塊放入，用15%～20%福爾馬淋溶液固定3～5d。

（2）浸洗：用蒸餾水每隔0.5h換洗1次，共換洗3h，之后用解剖刀將組織塊修整成長(zhǎng)約5mm、寬3mm的小塊。

（3）浸銀：將組織塊浸入25%的硝酸銀水溶液中，用濾紙將容器包裹起來(lái)，使其處于黑暗狀態(tài)下，避免硝酸銀受光氧化分解，然后放入37℃的恒溫箱中1～3d。

（4）用蒸餾水沖洗數(shù)次。

（5）浸入銀氨溶液中，浸泡3～5h。

（6）用蒸餾水略洗。

（7）還原：浸入福爾馬淋溶液中還原10～15h。

（8）用蒸餾水再次浸洗數(shù)分鐘。

（9）脫水：采用酒精脫水，濃度梯度分別為50%、70%、80%、90%、95%、無(wú)水酒精，每2個(gè)梯度的間隔時(shí)間為2h，最后用無(wú)水酒精重復(fù)脫水1次，然后依次將這些濃度的酒精倒入有組織塊的容器中。

（10）將脫完水的組織塊放入無(wú)水乙醇∶二甲苯=1∶1的溶液中浸泡1.5h。

（11）透明：采用二甲苯為透明劑，將脫水后的材料直接投入二甲苯溶液中浸泡20min。

（12）浸蠟：透明后將組織塊置入二甲苯∶石蠟=1∶1的混合液中約1.5h，之后放進(jìn)液狀石蠟中浸蠟，放入57℃的烘箱中12h。

（13）石蠟包埋：折疊數(shù)個(gè)長(zhǎng)方形紙盒，并將寫(xiě)有前、中、后腸的標(biāo)簽貼上，將紙盒放入1個(gè)較大一點(diǎn)的方形硬紙殼中，在硬紙殼底部開(kāi)1個(gè)小洞，以便水能順利流出，把烘箱中的液狀石蠟倒入小紙盒中，迅速將組織塊放入紙盒中的液狀石蠟中，組織塊的縱向要與小紙盒的縱向保持平行（便于以后修整石蠟，切片時(shí)能順利切出腸道的橫切面），然后往擺有小紙盒的大硬紙殼中源源不斷的注入自來(lái)水，以加速冷卻，待石蠟基本固定后，將小紙盒從大硬紙殼中取出，放入裝有自來(lái)水的水盆中冷卻數(shù)小時(shí)，直至石蠟完全凝固成形。

（14）切片、展片、貼片：將包埋有組織塊的石蠟從小紙盒中取出，按縱向修整成等腰梯形（后部留大一點(diǎn)容易將其固定在小木塊上），且6個(gè)平面要比較平滑，組織塊四周均留有余蠟，將石蠟塊按照不同批次和前、中、后腸分開(kāi)，然后放進(jìn)1個(gè)小塑料袋中，并標(biāo)上寫(xiě)有批次和前、中、后腸的標(biāo)簽。將修好的石蠟塊與小木塊放在酒精燈上微烤，把石蠟塊粘在小木塊上，把粘好的木塊固定在切片機(jī)上，把切片機(jī)的刻度調(diào)為6μm，手搖動(dòng)切片機(jī)，即可切出6μm厚的組織片，用毛筆接住切出的組織片，放在準(zhǔn)備好的濾紙上（事先準(zhǔn)備好濾紙和水盆，水盆中倒入37～42℃的溫水，放入溫度計(jì)，以便及時(shí)調(diào)整水溫），然后挑出較完整的2～3片，用鑷子夾住，迅速展入37～42℃的溫水中，讓其充分展開(kāi)，待組織片上的小氣泡完全消失后，用涂有中性膠的載玻片將組織片撈出，讓其附著于載玻片上，1個(gè)載玻片上放2段標(biāo)本，并將寫(xiě)好批次和前、中、后腸的標(biāo)簽紙貼上，放入染色缸中，將載玻片置于40.5℃的烘箱中烘烤2～3d。

（15）脫蠟：把烘箱中裝有載玻片的染色缸取出，倒入二甲苯脫蠟15min以上，然后移入另一個(gè)染色缸，再次脫蠟15min。

（16）將脫過(guò)蠟的載玻片一一擺在濾紙上，然后從烘箱中取出準(zhǔn)備好的蓋玻片。在組織片段上滴1滴中性樹(shù)膠之后，讓蓋玻片與載玻片呈45角，緩慢放下蓋玻片蓋住組織片，然后放入37℃烘箱中烘片3～4d。

1.4 觀察分析

（1）把做好的切片放在光學(xué)顯微鏡下用10×40倍的鏡片觀察，以一個(gè)視野為單位計(jì)嗜銀細(xì)胞的個(gè)數(shù)，并記錄。

（2）通過(guò)SAS of Windows 8.01 軟件，把記錄的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，得到試驗(yàn)結(jié)果。

2 結(jié)果

嗜銀細(xì)胞的胞質(zhì)與突起中充滿嗜銀顆粒，嗜銀顆粒呈黑色或黑棕色，背景為淡黃色或黃色，細(xì)胞核被染成黃色或淺黃色，對(duì)比非常鮮明，容易辨認(rèn)與區(qū)分。

2.2 嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)

嗜銀細(xì)胞的形狀多種多樣，有圓形、卵圓形、長(zhǎng)條形、紡錘形、長(zhǎng)頸瓶形、三角形、梨形以及其他各種不規(guī)則形狀，并有突起，其中8O%嗜銀細(xì)胞呈圓形和卵圓形，l0%左右為條形，其余為其他不同的形狀。

2.3 嗜銀細(xì)胞的分布密度

3 討論

3.1 嗜銀細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)與生理機(jī)能

克氏原螯蝦腸道上的嗜銀細(xì)胞多為開(kāi)放型細(xì)胞，主要有圓形、卵圓形，長(zhǎng)條形、紡錘形、長(zhǎng)頸瓶形、三角形、梨形等形態(tài)，這種形態(tài)特點(diǎn)揭示了形態(tài)隨所處部位的相鄰上皮細(xì)胞的排列方式以及本身功能所需而各異。嗜銀細(xì)胞是腸道的內(nèi)分泌細(xì)胞，早在本世紀(jì)初就有學(xué)者對(duì)嗜銀細(xì)胞進(jìn)行了研究，確認(rèn)嗜銀細(xì)胞是一種內(nèi)分泌細(xì)胞。也有一些學(xué)者支持外分泌功能，還有些學(xué)者認(rèn)為嗜銀細(xì)胞具有內(nèi)、外分泌2種功能。腸道內(nèi)分泌細(xì)胞能接受化學(xué)和物理刺激，并釋放5-羥色胺和各種激素到循環(huán)血液中去。本文也觀察到，嗜銀細(xì)胞從突起穿過(guò)基膜到達(dá)固有層，也見(jiàn)嗜銀顆粒直接從細(xì)胞到達(dá)固有層，另外還見(jiàn)有許多細(xì)胞的突起末端有散在的嗜銀顆粒，并靠近固有層，這和黃威權(quán)[7]等人觀點(diǎn)一樣，他們也認(rèn)為嗜銀顆?？梢酝ㄟ^(guò)擴(kuò)散和直接釋放2種形式到固有層?，F(xiàn)在研究結(jié)果表明，魚(yú)類(lèi)腸道內(nèi)分泌細(xì)胞釋放的激素對(duì)靶細(xì)胞有4種生理作用方式，即內(nèi)分泌、旁分泌、神經(jīng)內(nèi)分泌和腔內(nèi)分泌。本試驗(yàn)證實(shí)了克氏原螯蝦至少有其中2種方式，即內(nèi)分泌和腔內(nèi)分泌；關(guān)于旁分泌，本文也觀察到少量嗜銀細(xì)胞有突起伸向鄰近細(xì)胞，這為此種方式的存在提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。

3.2 嗜銀細(xì)胞的分布密度規(guī)律

到目前為止，國(guó)內(nèi)外學(xué)者僅在幾十種魚(yú)的胃腸道中發(fā)現(xiàn)嗜銀細(xì)胞，本試驗(yàn)觀察到克氏原螯蝦的腸道中有著豐富的嗜銀細(xì)胞?？耸显r嗜銀細(xì)胞以細(xì)胞群的形式分布在腸道的前、中、后腸，從前腸、中腸到后腸的分布密度呈遞減趨勢(shì)。這種分布規(guī)律與克氏原螯蝦的腸道消化特點(diǎn)相適應(yīng)，因?yàn)槭澄锸紫冗M(jìn)入腸道中的前腸，刺激前腸的嗜銀細(xì)胞分泌激素，此時(shí)食物對(duì)前腸有較大的機(jī)械刺激作用，食物中的化學(xué)成分濃度最大，所以前腸的嗜銀細(xì)胞最為豐富，因而加強(qiáng)了激素的分泌。隨著食物消化吸收的進(jìn)程，食物對(duì)腸的機(jī)械和化學(xué)刺激減弱，嗜銀細(xì)胞的分布密度漸疏。

筆者認(rèn)為，在對(duì)克氏原螯蝦的腸道組織化學(xué)研究中，由于自己在試驗(yàn)中的種種失誤和操作不熟練，也可能會(huì)導(dǎo)致某些結(jié)論比較片面，具體的研究結(jié)論還有待進(jìn)一步的研究加以證明。

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