摘 要：該文通過對(duì)酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）實(shí)驗(yàn)在食品分析教學(xué)中實(shí)施情況進(jìn)行探討。介紹了該實(shí)驗(yàn)的基本原理以及實(shí)施過程，并以在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域中較常用的競爭ELISA為例，論述了用ELISA檢測(cè)食品中有害小分子化學(xué)物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)步驟。為有關(guān)院校開展ELISA實(shí)驗(yàn)提供指導(dǎo)和借鑒。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附分析 綜合性實(shí)驗(yàn) 教學(xué)

中圖分類號(hào)：G421文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1674-098X（2013）05（a）-0149-02

食品分析是食品科學(xué)與工程專業(yè)重要的專業(yè)基礎(chǔ)課程之一。食品分析實(shí)驗(yàn)課是食品分析教學(xué)的重要組成，是鍛煉學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作能力，分析解決問題能力的重要教學(xué)途徑之一。酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）技術(shù)涉及有機(jī)化學(xué)、食品化學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)等綜合知識(shí)內(nèi)容，在食品分析學(xué)中開展ELISA綜合性實(shí)驗(yàn)，不僅利于提高教學(xué)質(zhì)量，而且能鍛煉學(xué)生綜合技能運(yùn)用能力。

1 ELISA綜合實(shí)驗(yàn)在教學(xué)中開展的意義

酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)是一種固相免疫分析方法，因其具有靈敏、快速、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，迅速發(fā)展，在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域應(yīng)用越來越廣泛，成為食品中小分子有害因子主要的快速篩查技術(shù)手段[1]。目前，對(duì)于食品中的農(nóng)藥、獸藥殘留，生物毒素，致病微生物等有害物質(zhì)的分析，市面上已有商品化的ELISA試劑盒[2]。但本科教學(xué)極少開展ELISA教學(xué)，學(xué)生對(duì)其原理和操作了解較少，缺乏實(shí)驗(yàn)機(jī)會(huì)，相關(guān)知識(shí)的理解主要停留在理論教學(xué)水平。在食品專業(yè)開設(shè)ELISA實(shí)驗(yàn)課程，已成為一項(xiàng)非常必要的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容。有助于幫助學(xué)生學(xué)習(xí)對(duì)相關(guān)知識(shí)點(diǎn)的學(xué)習(xí)及掌握，提高學(xué)生對(duì)生物分析技術(shù)的認(rèn)識(shí)，了解免疫分析技術(shù)在食品安全領(lǐng)域應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)及重要性，并鍛煉學(xué)生動(dòng)手能力，培養(yǎng)學(xué)生的綜合素質(zhì)。

2 ELISA實(shí)驗(yàn)的原理

ELISA技術(shù)是用酶標(biāo)記的抗原或酶標(biāo)記的抗體為主要試劑，通過復(fù)合物中的酶催化底物呈色反應(yīng)來對(duì)被測(cè)物進(jìn)行定性或定量的一種免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性，在測(cè)定時(shí)，將受檢樣品（測(cè)定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)，形成抗原抗體復(fù)合物，用洗滌的方法使固相載體上的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與樣品中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，通過定性或定量分析有色產(chǎn)物即可確定樣品中待測(cè)物質(zhì)的含量[4-5]。目前ELISA 的分類方法眾多，主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、捕獲法、競爭法。在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，競爭法為主要類型[6]。檢測(cè)原理示意圖見圖1。

3 實(shí)施過程及具體實(shí)驗(yàn)步驟

根據(jù)筆者的教學(xué)經(jīng)驗(yàn)，該綜合性實(shí)驗(yàn)約需教學(xué)時(shí)數(shù)，10～12學(xué)時(shí)，具體操作過程如下。

（1）帶教老師講述ELISA的原理，應(yīng)用及注意事項(xiàng)。

（2）通過觀看酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)操作視頻，了解整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程及操作要點(diǎn)。

（3）將學(xué)生分組，每組3人，開展ELISA綜合實(shí)驗(yàn)。

（4）實(shí)驗(yàn)操作結(jié)束，帶教老師與學(xué)生共同討論分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

具體的實(shí)驗(yàn)操作步驟如下：

以測(cè)定牛奶和魚肉中的氯霉素為例，采用酶標(biāo)抗原的直接競爭法，介紹本實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)步驟。

（1）包板：將抗體用包被液稀釋一定的倍數(shù)，加入96孔酶標(biāo)板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，過夜。

（2）封板：洗板兩次，加入封閉液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小時(shí)。

（3）樣品前處理：封板時(shí)，分別對(duì)樣品牛奶和雞肉進(jìn)行前處理。

（4）烘干：將封閉好的板倒掉封閉液，37℃烘干。

（5）加樣：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50 μL/孔，然后加入酶標(biāo)記物50 μL/孔，再振蕩混勻，用封板膜蓋板，37 ℃條件下反應(yīng)30 min。

（6）顯色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物緩沖液50 μL，再加底物液50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃或室溫環(huán)境避光顯色10 min。

（7）測(cè)定：每孔加入終止液50 μL，輕輕振蕩勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)定吸光度值。

（8）結(jié)果判定：以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/mL）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中氯霉素實(shí)際濃度。

4 結(jié)語

ELISA實(shí)驗(yàn)是一個(gè)綜合性實(shí)驗(yàn)，涉及到有機(jī)化學(xué)，食品化學(xué)，生物化學(xué)以及免疫學(xué)等方面的相關(guān)知識(shí)。因此，學(xué)生通過本實(shí)驗(yàn)，可以取得以下效果：（1）鞏固理論知識(shí)，加強(qiáng)對(duì)相關(guān)知識(shí)的理解，并對(duì)該技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的重要性有一定的認(rèn)識(shí)。（2）結(jié)合視頻及具體實(shí)驗(yàn)操作，了解整個(gè)實(shí)驗(yàn)的操作流程。（3）學(xué)生之間分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加強(qiáng)相互協(xié)作及團(tuán)隊(duì)意識(shí)。

在食品科學(xué)與工程、食品營養(yǎng)、食品質(zhì)量與安全、生物工程等專業(yè)的食品分析實(shí)驗(yàn)課中，我們?yōu)椴糠滞瑢W(xué)開設(shè)了ELISA綜合實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)過的對(duì)象包括氯霉素、鹽酸克倫特羅、三聚氰胺、和孔雀石綠等。本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容豐富充實(shí)，實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象生動(dòng)有趣，深受學(xué)生的歡迎。

參考文獻(xiàn)

[1]何紫薇，郭琦.酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)在食品檢驗(yàn)的發(fā)展應(yīng)用[J].生物科技與醫(yī)藥衛(wèi)生，2011（11）：71-72.

[2]李明堯.酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）技術(shù)在食品檢驗(yàn)的發(fā)展應(yīng)用[J].中國醫(yī)藥指南，2012，10（35）：380-381.

[3]王守法，闞春月，許學(xué)書.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)在食品檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品科學(xué)，2009，30（23）：489-492.

[4]孫太凡.酶聯(lián)免疫吸附分析技術(shù)在農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（22）：11981-11983.

[5]Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.

[6]張占軍，王富花.酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)及其在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā)，2011，32（1）：157-159.