摘要：以人附睪cDNA為模板，PCR擴增RNase10基因，構建pET32b（+）-RNase10體外表達載體，轉化大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞DH5α，挑選陽性克隆，提取質粒轉化BL21（DE3），IPTG誘導RNase10基因的表達，采用SDS-PAGE法檢測表達產物，結果顯示融合蛋白分子量為24 ku，與預期相符，表明人附睪RNase10基因在大腸桿菌中成功表達。

關鍵詞：人附睪RNase10基因；大腸桿菌（Escherichia coli）；表達

中圖分類號：Q786 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4245-03

Expression of Human Epididymis RNase10 Gene in Escherichia coli

LIU Xiao-ling，LIU Xue，WANG Min-qiang，WEI Hai-tao

（College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China）

Abstract： Using human epididymis cDNA as template， RNase10 gene was amplified and recombined into prokaryotic expression vector pET32b（+）， which was constructed and transformed into Escherichia coli DH5α. Plasmids were extracted from positive clones， and transformed into BL21（DE3）. Furthermore， the protein expression of RNase10 was induced by IPTG. A band about 24 ku was detected by SDS-PAGE， showing that RNase10 of human epididymis was expressed successfully in cell of E. coli DH5α.

Key words： RNase10 gene of human epididymis； Escherichia coli； expression

收稿日期：2012-11-05

基金項目：煙臺大學青年基金項目（SM11Z7）

作者簡介：劉曉玲（1976-），女，山東萊州人，講師，博士，主要從事分子生物研究，（電話）0535-6902638（電子信箱）lxl2008i@163.com。

RNase A超家族（Ribonuclease A superfamily）是結構生物學與生物化學領域的研究熱點，研究表明RNase A超家族的成員參與消化、血管生成及先天性免疫等多種生物過程[1]。RNase10（Ribonuclease 10）基因主要表達在附睪的頭部，基因表達實驗數據表明RNase10與男性生殖功能相關[2]，進一步推測該基因在受精過程中具有重要意義[3]。本研究克隆人附睪RNase10基因，構建了大腸桿菌（Escherichia coli）表達載體并獲得蛋白，為進一步闡明RNase10基因在精子相關生理過程中的功能奠定實驗基礎，對研究男性不育具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌DH5α、BL21（DE3），載體pET32b（+），T4 DNA連接酶、限制性內切酶及其他工具酶，IPTG，X-gal等購自寶生物工程（大連）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設計合成，其他試劑為分析純，人附睪cDNA模板由煙臺毓璜頂醫(yī)院惠贈。

DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀及搖床（北京市六一儀器廠）；5810R型高速冷凍離心機（Eppendorf公司）；電熱恒溫水浴鍋（山東龍口市先科儀器公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國UVP公司）；TC-XP型基因擴增儀（杭州博日科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 根據NCBI數據庫中人RNase10基因序列（序列號：NM_001012975）設計引物，對其信號肽切割位點和pET32b（+）載體多克隆位點進行分析，在去除了信號肽的RNase10基因DNA序列兩端分別加上KpnⅠ及EcoRⅠ的酶切位點和保護堿基，另外在上游引物處添加腸激酶位點以便在融合表達后獲取目的蛋白序列[4]，引物序列為P1，5′-TTGGTACCGACGACGACGACAAGCTTCA

TATGGCTACAGCAG-3′；P2，5′-GGCGAATTCTCAT

TGTCCAGTTGGTAACTGGCGCTTC-3′（下劃直線部分分別為KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點，曲線部分為腸激酶位點），目標片段長度為611 bp。

1.2.2 目的基因的PCR擴增及純化 PCR反應體系包括2 μL 10×PCR Buffer （含Mg2+ 25 mmol/L），1.6 μL dNTP （2.5 mmol/L），上、下游引物各1 μL（10 μmol/L），0.5 μL Taq聚合酶（2.5 U/μL），1 μL cDNA模板，加滅菌水至總反應體積為20 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測并利用膠回收試劑盒回收目的條帶。

1.2.3 目的基因與載體的連接 分別對pET32b（+）質粒載體和目的基因進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定并利用膠回收試劑盒回收純化后將載體與目的基因連接，連接反應體系為10 μL，包含5 μL酶切后的載體、3 μL目的DNA片段、1 μL 10×DNA連接緩沖液、1 μL T4 DNA連接酶，16 ℃連接過夜。

1.2.4 克隆測序 利用CaCl2轉化法將連接產物轉化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，利用抗性篩選及菌落PCR檢測轉化結果，陽性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.2.5 蛋白誘導表達與檢測 將測序結果與RNase 10基因序列一致的陽性克隆大量培養(yǎng)后提取質粒，進一步轉化到表達宿主BL21（DE3）中，篩選的陽性克隆于37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm達0.6左右，取1 mL培養(yǎng)物12 000 r/min離心1 min，收集細胞沉淀，添加IPTG至終濃度為1 mmol/L，分別誘導表達0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 h后離心收集菌體，沉淀中加SDS-PAGE變性上樣緩沖液，100 ℃水浴5 min后采用14%的不連續(xù)SDS-PAGE檢測表達產物。

2 結果與分析

2.1 人附睪RNase10基因PCR擴增結果

采用設計的引物對人附睪RNase10基因進行擴增，PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果見圖1，產物大小約為610 bp，與預期相符，表明人附睪RNase10基因擴增成功。

2.2 酶切及重組質粒構建結果

擴增得到的人附睪RNase10基因及質粒載體分別進行KpnⅠ及EcoRⅠ雙酶切，酶切產物膠回收后采用T4 DNA連接酶連接，形成長約6 400 bp的重組質粒，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖2。與酶切后載體相比，重組質粒的條帶長度大于質粒空載體，說明重組成功。

2.3 測序結果

將重組質粒轉化到DH5α中培養(yǎng)，篩選陽性克隆送交生工生物工程（上海）股份有限公司測序，結果顯示重組表達載體中的目的基因完整且未發(fā)生變異[5]。

2.4 融合蛋白在BL21（DE3）中的表達

對陽性克隆進行培養(yǎng)并提取質粒，轉化到BL21（DE3）中，添加1 mmol/L IPTG誘導目的基因的表達，收集各時間段的表達產物進行不連續(xù)SDS-PAGE檢測，結果見圖3。從圖3可知，人附睪RNase10基因表達產物的蛋白質分子量大小約為24 ku，采用Dnastar軟件對數據庫中人附睪RNase10基因的序列進行分析，預測去除信號肽后該蛋白的大小約為21 ku，而組氨酸標簽的分子量約為3 ku[6]，可見誘導表達的蛋白質分子量與預測的RNase10分子量大小相符。隨著誘導時間的延長，融合蛋白的SDS-PAGE條帶寬度和亮度都增加，可見融合蛋白的表達量隨著誘導時間的延長而增加。

3 小結與討論

RNase A超家族是脊椎動物特異性酶家族，該家族成員參與脊椎動物的多種生命活動[2]。前期研究表明，RNase10基因主要在人附睪的頭部表達。而附睪除能貯存精子外還能分泌有助于精子成熟的附睪液，故附睪與精子成熟、運動、獲能以及受精等多種生理功能密切相關[7]。RNase10基因作為附睪特異表達的基因，對于男性生殖有一定的作用，通過體外蛋白的誘導表達，可以為進一步研究該基因在男性生殖生理過程中的功能奠定基礎，對研究男性不育具有重要意義。

本研究構建了人附睪RNase10基因的體外表達載體，經過誘導表達獲得了大小約為24 ku的融合蛋白。電泳結果顯示本實驗獲得的融合蛋白條帶清晰明亮，表明得到的人附睪RNase10基因表達產物純度和表達量均較高，為后期蛋白質功能的研究奠定了基礎。

參考文獻：

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[2] CHO S， ZHANG J. Ancient expansion of the ribonuclease a superfamily revealed by genomic analysis of placental and marsupial mammals[J]. Gene，2006，373：116-125.

[3] CHO S， BEINTEMA J J， ZHANG J. The ribonuclease a superfamily of mammals and birds： Identifying new members and tracing evolutionary histories[J]. Genomics，2005，85：208-220.

[4] 徐 良，王文靜，祖向陽，等.腸激酶消化融合蛋白Trx-Exendin-4的特性[J].河南科學，2012，30（2）：192-195.

[5] 孫玉科，張彥杰，李 娜，等.人促凋亡蛋白基因bax的克隆與原核表達[J].湖北農業(yè)科學，2012，51（13）：2858-2861.

[6] 李 寧，李建遠.附睪小體及其相關蛋白研究進展[J].醫(yī)學研究雜志，2010，39（7）：118-120.

[7] 國 果，吳建偉，吳沁怡，等.家蠅幾丁質酶基因的序列分析、克隆和誘導表達[J]. 中國人獸共患病學報，2012，28（6）：570-573.

（責任編輯 向 闈）