摘要：利用巢式PCR方法克隆斑馬魚（Danio rerio）腫瘤壞死因子受體2（TNFR2）基因，該基因全長1 242 bp，編碼413個氨基酸，分子質(zhì)量44.68 ku，等電點5.90。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，TNFR2基因在斑馬魚胚胎發(fā)育時期的表達(dá)量呈現(xiàn)下降后趨于穩(wěn)定，在斑馬魚不同組織中均能檢測到，并且表達(dá)豐度差別不大，在肌肉中表達(dá)量最高，在腸道中表達(dá)量最低。

關(guān)鍵詞：斑馬魚（Danio rerio）；腫瘤壞死因子受體2；實時熒光定量PCR

中圖分類號：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4171-04

Cloning and Expressing Analysis of TNFR2 Gene of Zebrafish

QI Lin1，YU Ying-cai2，XIANG Zhi-ming3，LI Jun4

（1.Railway Police College， Zhengzhou 450053， China； 2.Department of Biochemistry，Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine， Nanchang 330004， China； 3.South China Sea Institute of Oceanology， Chinese Academy of Sciences， Guangzhou 510301， China；

4.School of Pharmaceutical， Liaocheng University， Liaocheng 252000， Shandong， China）

Abstract： Tumor necrosis factor receptor2（TNFR2） of zebrafish was isolated using nest PCR method. The gene was 1 242 bp，encoding 413 amino acids. The deduced molocular mass and pI was 44.68 ku and 5.90 respectively. The realtime qPCR results showed that TNFR2 gene was in“descent-stabilization” pattern during the development period. TNFR2 gene was expressed in different tissues of zebrafish， and highly expressed in muscle， lowly expressed in gut.

Key words： zebrafish（Danio rerio）； TNFR2； realtime qPCR

收稿日期：2013-02-18

基金項目：公安部科技創(chuàng)新項目（2012YYCXTDGZ139）。

作者簡介：齊 麟（1981-），男，河南開封人，副教授，博士，主要從事分子生物學(xué)研究，（電話）13460344268（電子信箱）qilin@rpc.edu.cn；

通訊作者，李 軍，（電子信箱）think.a@163.com。

腫瘤壞死因子超家族（Tumor necrosis factor super family，TNFSF）是機(jī)體免疫反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等諸多細(xì)胞應(yīng)答進(jìn)程[1]。腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）是一類具有多種生物效應(yīng)的細(xì)胞因子，自從1983年發(fā)現(xiàn)第一個TNF家族成員TNFα[2]，研究者已經(jīng)鑒定了約20個腫瘤壞死因子。TNF通過與TNFR（TNFR1和TNFR2）結(jié)合而發(fā)揮了相應(yīng)的生物學(xué)功能[3]。TNFR1和TNFR2都是Ⅰ型跨膜糖蛋白，在胞膜外存在約由40個氨基酸殘基組成的富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域（Cystein rich domain，CRD）[4]。TNFR1在絕大多數(shù)細(xì)胞中表達(dá)，而TNFR2則主要在上皮細(xì)胞中表達(dá)[5]。TNFR1主要通過募集FADD和TRADD等分子傳遞信號[6]，而TNFR2則通過與TRAF家族結(jié)合傳遞信號[7]，最終都是激活NF-κB信號通路[8]。本研究通過巢式PCR方法克隆獲得了斑馬魚（Danio rerio）TNFR2基因全長，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)進(jìn)化分析。同時，通過實時熒光定量PCR（Realtime qPCR）對斑馬魚TNFR2基因在各個組織及受精后胚胎中進(jìn)行表達(dá)譜分析，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型性成熟斑馬魚購自鄭州市花鳥魚蟲市場，E. coli DH5α由鐵道警察學(xué)院生化快速鑒別實驗室保存，pGEM-T Vector購自Promega公司，RNA提取試劑盒Trizol Reagent （Cat. No. 15596-018） 購自Invitrogen公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（AMV RNA PCR Ver.3.0）、LA-Taq DNA聚合酶（5 U/μL）和DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司，Realtime qPCR Mix 購自TOYOBO公司，PCR產(chǎn)物凝膠回收試劑盒為Omega公司產(chǎn)品，dNTPs購自鼎國生物技術(shù)公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成和序列測定均由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 斑馬魚TNFR2基因全長的克隆 斑馬魚總RNA的提取及cDNA的反轉(zhuǎn)錄合成參照試劑盒說明書，合成的cDNA加滅菌雙蒸水稀釋5倍做擴(kuò)增模板備用。根據(jù)GenBank中TNFR2基因序列（基因編號：NM_0010 89510）設(shè)計引物擴(kuò)增TNFR2全長。第一輪PCR上游引物序列：5′-TTTCACCATTTCCG

AGAC-3′，下游引物序列：5′-ATGCTGCTTTGTTTA

CTCTT-3′。PCR反應(yīng)體系為：cDNA模板1 μL、10×PCR Buffer 2 μL、dNTPs（2.5 mmol/L） 1 μL、LA-Taq DNA聚合酶0.2 μL、上下游引物各1 μL，加滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，20個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將第一輪PCR產(chǎn)物用滅菌雙蒸水稀釋5倍后作為模板進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增。第二輪PCR上游引物：5′-GCACGGTTATTGTT

GTTAT-3′，第二輪PCR下游引物：5′-TTGCGATGC

TAGATGTTT-3′。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后，與pGEM-T Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過菌落PCR鑒定陽性克隆，送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，并將陽性菌株保存于-70 ℃。

1.2.2 斑馬魚TNFR2基因序列生物信息學(xué)分析 斑馬魚TNFR2蛋白序列的推導(dǎo)使用“Translate tool”工具（http：//cn.expasy.org/tools/dna.html），蛋白分子質(zhì)量與等電點預(yù)測使用“Computer pI/Mw”工具（http：//cn.expasy.org/tools/pi_tool.html），蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測分析使用“SMART”工具（http：//smart.embl-heidelberg.de/），蛋白跨膜區(qū)分析使用“TMHMM”工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/），蛋白疏水性分析使用“ProtScale”工具（http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl）。登陸“expasy”網(wǎng)站，通過“BLAST”工具搜索蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫獲得魚類TNFR2同源蛋白序列，利用MEGA4.1軟件NJ法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 斑馬魚TNFR2基因表達(dá)譜分析 解剖分離斑馬魚11個組織（肌肉、腦、眼、腮、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腸道、精巢和卵巢），收集斑馬魚7個不同發(fā)育時期的胚胎（受精后6、12、24、36、48、96和120 h），參照“1.2.1”方法提取各組織的總RNA并合成cDNA。cDNA稀釋5倍后作為Realtime qPCR模板備用。內(nèi)參基因為β-actin，上下游引物分別為： 5′-ATGCCCCTCGTGCTGTTTTC-3′和5′-GCCTCATCT

CCCACATAGGA-3′。斑馬魚TNFR2基因Realtime qPCR上、下游引物分別為：5′-CTGGTGCTGTTGTG

GTGG-3′和5′-GGCTCTGTCTGGGTTCTG-3′。Realtime qPCR反應(yīng)體系為：2×Realtime PCR Master Mix 10 μL、上下游引物各0.5 μL、cDNA模板1 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)至20 μL。Realtime qPCR程序為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。利用“ABI PRISIM 7900HD SDS”軟件進(jìn)行相對定量數(shù)據(jù)分析，胚胎發(fā)育表達(dá)譜分析中將TNFR2基因在魚卵受精后24 h胚胎中的表達(dá)量設(shè)定為1，組織分布表達(dá)譜分析中將TNFR2基因在腸道中的表達(dá)量設(shè)定為1。

2 結(jié)果與分析

2.1 斑馬魚TNFR2基因全長的克隆

以斑馬魚總RNA為模版，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過巢式PCR后，擴(kuò)增得到斑馬魚TNFR2基因全長，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物（圖1）。從圖1中可以看出，擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，與目的片段大小一致（約1 242 bp）。

2.2 斑馬魚TNFR2基因的生物信息學(xué)分析

斑馬魚TNFR2基因全長1 242 bp，編碼413個氨基酸，分子質(zhì)量為44.68 ku，等電點5.90。通過“SMART”工具分析，斑馬魚TNFR2蛋白質(zhì)在22-60、62-104、105-148以及150-188氨基酸殘基位點存在4個“TNFR家族半胱胺酸豐富”結(jié)構(gòu)域（TNFR/NGFR family cysteine-rich region domain），在蛋白質(zhì)中部存在一個跨膜結(jié)構(gòu)域（圖2）?！癟MHMM”工具分析證實跨膜結(jié)構(gòu)域位于斑馬魚TNFR2蛋白質(zhì)第238-260氨基酸殘基。斑馬魚TNFR2蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域表現(xiàn)出疏水性，其余部分均表現(xiàn)出強(qiáng)親水性。

2.3 魚類TNFR2蛋白質(zhì)的系統(tǒng)發(fā)育分析

通過選取具有代表性的魚類TNFR2蛋白質(zhì)序列，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖3），從圖3中可以看出，TNFR2的進(jìn)化趨勢和物種進(jìn)化趨勢基本一致，斑馬魚TNFR2與和其親緣關(guān)系最近的鯽魚TNFR2最先聚類到一起。

2.4 斑馬魚TNFR2基因表達(dá)分布分析

利用實時熒光定量PCR技術(shù)，對斑馬魚TNFR2基因在胚胎發(fā)育時期和成魚各個組織的表達(dá)分布進(jìn)行了分析（圖4）。在整個發(fā)育過程中，TNFR2基因均有表達(dá)，但表達(dá)量不一致。斑馬魚卵受精后6 h為整個胚胎發(fā)育時期表達(dá)最高峰，從12～120 h時TNFR2基因表達(dá)量均維持到一個較低水平，并且變化不大。

TNFR2在斑馬魚不同組織中均能檢測到，且表達(dá)豐度差別不大：TNFR2在肌肉中表達(dá)最高，在腸道中表達(dá)最低，在肌肉中的表達(dá)豐度也僅為在腸道中表達(dá)豐度的6倍左右（圖5）。

3 小結(jié)與討論

TNFR1與TNFR2均能與TNFα結(jié)合，且具有一定的同源性，其差別在于TNFR1含有一個死亡結(jié)構(gòu)域（Death domain），而TNFR2則不含此結(jié)構(gòu)域[9]。本研究中克隆獲得的基因經(jīng)序列分析，不含有死亡結(jié)構(gòu)域，確定為斑馬魚TNFR2。在魚類TNFR2蛋白質(zhì)中，均具有極為類似的核心結(jié)構(gòu)，其主要差異在于末端長度，這部分序列很可能是冗余區(qū)域，在進(jìn)化中逐漸被簡化淘汰。

表達(dá)譜分析結(jié)果顯示斑馬魚TNFR2基因mRNA水平在整個胚胎發(fā)育期呈現(xiàn)明顯的“下降后保持穩(wěn)定”模式，表明TNFR2對斑馬魚胚胎形成具有重要意義，且其表達(dá)量受時間嚴(yán)格控制。TNFR2具有細(xì)胞炎癥放大的免疫學(xué)功能，在胚胎發(fā)育過程中與早產(chǎn)密切相關(guān)[10]。胚胎發(fā)育的早期，斑馬魚等低等脊椎動物可能通過TNFR2的高表達(dá)應(yīng)對外界環(huán)境壓力，發(fā)揮免疫學(xué)功能。而隨著胚胎發(fā)育的逐步完善，大量免疫蛋白的合成，TNFR2的免疫學(xué)功能被其他免疫蛋白取代，表達(dá)量開始急速下降，表達(dá)量及時下降避免了TNFR2誘導(dǎo)的病理性損傷，與人類比較相似[11]。TNFR2在所檢測的斑馬魚11個組織中均有表達(dá)，且表達(dá)豐度差別不大，說明它是組成型表達(dá)，與哺乳動物TNFR2基因mRNA表達(dá)較為相似。人類TNFR2的高表達(dá)可以影響腸上皮細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，與腸道慢性炎癥呈正相關(guān)[12]。斑馬魚腸道TNFR2基因mRNA表達(dá)量最低的原因可能與此有關(guān)，即證明從魚類到人類，TNFR2盡管同源性變化較大（僅30%左右），但在進(jìn)化壓力脅迫下依然保持了原始的基因功能。

參考文獻(xiàn)：

[1] DEMPSEY P W， DOYLE S E， HE J Q， et al. The signaling adaptors and pathways activated by TNF superfamily[J]. Cytokine Growth Factor Rev，2003，14（3）：193-209.

[2] PENNICA D， NEDWIN G E， HAYFLICK J S， et al. Human tumour necrosis factor： Precursor structure expression and homology to lymphotoxin[J]. Nature，1983，312（5996）：724-729.

[3] WAJANT H， PFIZEMAIER K， SCHEURICH P. Tumor necrosis factor signaling[J]. Cell Death Differentiation，2003，10（1）：45-65.

[4] LOCKSLEY R M，KILLEEN N， LENARDO M J. The TNF and TNF receptor superfamilies： Integrating mammalian biology[J]. Cell，2001，104（4）：487-501.

[5] YARILINA A， PARK-MIN K H， ANTONIV T， et al. TNF activates an IRF1-dependent autocrine loop leading to sustained expression of chemokines and STAT1-dependent type I interferon-response genes[J].Nat Immunol，2008，9（4）：378-387.

[6] CHEN G， GOEDDEL D V. TNF-R1 signaling： A beautiful pathway[J]. Science，2002，296（5573）：1634-1635.

[7] MACEWAN D J. TNF receptor subtype signaling： Differences and cellular consequences[J]. Cell Signal，2002，14（6）：477-492.

[8] HOLTMANN M H， NEURATH M F. Differential TNF-signaling in chronic inflammatory disorders[J]. Curr Mol Med，2004， 4（4）：439-444.

[9] PIMENTEL-MUINOS F X， SEED B. Regulated commitment of TNF receptor signaling： A molecular switch for death or activation[J]. Immunity，1999，11（6）：783-793.

[10] 蒲 杰. TNF-α、TNFRⅡ及其基因多態(tài)性與早產(chǎn)的相關(guān)性研究[D].成都：四川大學(xué)，2006.

[11] FAUSTMAN D， DAVIS M. TNF receptor 2 pathway： Drug target for autoimmune diseases[J]. Nat Rev Drug Discov，2010， 9（6）：482-493.

[12] ROJAS-CARTAGENA C，F(xiàn)LORES I， APPLEYARD C B. Role of tumor necrosis factor receptors in an animal model of acute colitis[J]. Cytokine，2005，32（2）：85-93.

（責(zé)任編輯 屠 晶）