摘要：利用PCR方法克隆烏花雜交龜線粒體DNA的細胞色素b基因（Cyt b基因），并結合GenBank中已公布的22種龜鱉類動物同源序列進行了序列變異比較和系統(tǒng)發(fā)生分析，采用NJ（Neighbor-joining）法和UPGMA法構建分子系統(tǒng)樹。結果表明，烏花雜交龜與中華草龜（Chinemys reevesii）以很高的置信度聚成一支，再與中華花龜（Ocadia sinensis）聚成一組。

關鍵詞：中華草龜（Chinemys reevesii）；中華花龜（Ocadia sinensis）；雜交龜；Cyt b基因；系統(tǒng)進化

中圖分類號：Q959.6+3 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4167-04

Study on the Phylogenetic Relation of Hybrid Turtle（Chinemys reevesii♀×Ocadia sinensis♂） Based on Cyt b Gene

HE Gang1，2，HE Li1，F(xiàn)ANG Chun-lin2，F(xiàn)EI Chun-ping3，CHENG Bi-jun4

（1.Yangtze River Fisheries Research Institute， Chinese Academy of Fishery Sciences， Wuhan 430223， China； 2.Scientific Observing and Experimental Station of Fishery Resources and Environment in Poyang Lake， Ministry of Agriculture/Fisheries Research Institute of Jiangxi Province， Nanchang 330039， China； 3.Jiangxi Jinguiwang Business Co.，Ltd.， Shangrao 334400， Jiangxi， China；4.Institute of Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China）

Abstract： The complete sequences of Cytochrome b（Cyt b）gene in the hybrid turtle were amplified by using PCR technology. Meanwhile， the homologous sequences of other 22 turtle species were obtained from the GenBank. Based on these data， the sequence variation and the phylogenetic relationship of these groups were analyzed. The phylogenetic trees were constructed using Neighbor-joining（NJ）and UPGMA methods. The results showed that the hybrid turtle and Chinemys reevesii firstly gathered into one clade，and then formed a group with Ocadia sinensis.

Key words： Chinemys reevesii； Ocadia sinensis； hybrid turtle； Cyt b gene；phylogenetic evolution

收稿日期：2013-03-13

基金項目：國家公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項（201003076）

作者簡介：賀 剛（1982-），男，湖北天門人，助理研究員，碩士，主要從事種質(zhì)資源與魚類分子生態(tài)學研究，（電話）15070865732（電子信箱）

xyz001619@163.com；通訊作者，何 力，研究員，（電子信箱）heli28@sohu.com。

中華草龜（Chinemys reevesii）俗稱烏龜、泥龜、草龜，隸屬于龜鱉目（Testudinate）地龜科（Emydidae）烏龜屬（Chinemys）；而中華花龜（Ocadia sinensis）又名花龜、珍珠龜、臺灣草龜，隸屬于龜鱉目（Testudinate）潮龜科（Bataguridae）花龜屬（Ocadia）。除我國東北部和西部區(qū)域外，中華草龜在我國各地均有分布，而在國外主要分布于日本和朝鮮[1]；中華花龜主要分布于我國南部、臺灣及越南北部。兩種龜?shù)娜斯し敝臣帮曫B(yǎng)已獲得成功，中華草龜?shù)酿B(yǎng)殖規(guī)模較大，而中華花龜養(yǎng)殖規(guī)模較小[2]。目前已發(fā)現(xiàn)20多種雜交龜，部分是人工培育而成，如烏花雜交龜、烏黃喉雜交龜?shù)?。近年來，盡管新雜交龜品種日益增加，但是其相關研究鮮有報道，僅見金石雜交龜[3]、烏花雜交龜[4，5]，在分類學上不同屬間的雜交為屬間遠緣雜交。

線粒體DNA（mtDNA）作為核外遺傳物質(zhì)，具有結構簡單、母系遺傳、進化速度快、拷貝數(shù)多等特點，在動植物種群遺傳結構分析、物種及品系鑒定方面得到了廣泛的應用[6，7]。細胞色素b（Cyt b）是線粒體編碼的為數(shù)不多的功能蛋白之一，在進化上較為保守，通常被用于分子進化和系統(tǒng)發(fā)生的研究。本研究利用線粒體Cyt b基因分析烏花雜交龜?shù)男蛄腥L，并結合龜鱉目其他物種同源序列進行序列分析和系統(tǒng)進化樹的構建，探討烏花雜交龜在淡水龜科的地位及系統(tǒng)分化關系，為龜類動物種質(zhì)保護和雜交選育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

烏花雜交龜（中華花龜♂×中華草龜♀）由江西省烏龜良種場提供。

1.2 基因組DNA的提取

解剖烏花雜交龜，取少許肌肉組織，用無水乙醇浸泡，置于-20 ℃保存。提取基因組DNA，采用SDS/蛋白酶K消化，氯化鈉-氯仿抽提和乙醇沉淀，以1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測濃度后，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計及PCR擴增

參照中華草龜線粒體Cyt b基因序列，設計1對特異性擴增引物：Cytb F：5′-CATACACG CMTTCT

TYAAAGC-3′；Cytb R：5′-CTAATAGTGATCCGAAG

TTTCAT-3′，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增反應體系為：10×PCR緩沖液5 μL，2.5 mmol/L MgCl2 5 μL，10 mmol/L dNTPs 0.5 μL，10 pmol/L上、下游引物各2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）2 U，模板DNA（約100 ng）1 μL，加無菌水補至50 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性40 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物回收純化后，以兩端引物作測序引物，送至北京天一輝遠生物科技有限公司進行雙向測序。

1.4 序列分析

利用Clustal X軟件對測序結果與GenBank中同源序列進行DNA序列分析并人工校正。應用Mega4.1軟件分析統(tǒng)計不同序列的保守位點、可變位點、簡約信息位點、4個堿基含量及遺傳距離等數(shù)據(jù)。在Kimura-2-Parameter方法模型的基礎上，用UPGMA法和Neighbor-joining（NJ）法構建系統(tǒng)發(fā)生樹，Boot-strap重復檢測分子系統(tǒng)樹的置信度。

2 結果與分析

2.1 序列組成及變異

通過測定烏花雜交龜線粒體Cyt b基因全長序列，BLAST比對另外22種淡水龜科物種及中華鱉同源區(qū)序列后，對位排列共有1 150個位點， 其中682個保守位點， 468個變異位點，含318個簡約信息位點，位點變異率為40.7%。

序列中T、C、A、G含量分別為27.4%、31.2%、29.2%、12.2%（表1），結果顯示G堿基相對缺乏， 其中A+T含量（56.6%）高于C+G含量（43.4%）。從氨基酸密碼子來看，第1位點A堿基的頻率最高為28.3%，第2位點T堿基的頻率較高為39.0%，第3位點C堿基的含量高達40.2%，而G堿基的含量最低。

2.2 堿基替換和遺傳距離分析

不同物種序列間的堿基替換情況和基于Kimura-2-Paramete模型校正后的遺傳距離見表2。物種間序列位點變異表現(xiàn)為轉(zhuǎn)換多于顛換，R（轉(zhuǎn)換/顛換）平均值為3.60。脊椎動物中轉(zhuǎn)換率往往高于顛換率，Cyt b基因密碼子主要發(fā)生在第3位點，其替換頻率顯著高于前2位。

采用Mega4.1軟件計算各龜鱉群體間的K2P距離。在23個物種中，遺傳距離在0.01～0.28之間。其中，最小的在金頭閉殼龜與三線閉殼龜、齒緣龜與條頸龜之間，遺傳距離均為0.01；而外群的中華鱉與內(nèi)群龜科物種的遺傳距離均較大，在0.26～0.28之間。烏花雜交龜在21種內(nèi)群龜?shù)倪z傳距離為0.02～0.16。雜交龜與中華草龜遺傳距離最小（0.02），與中華花龜次之（0.03），與條頸龜和果龜最大（0.16）。在內(nèi)群中，屬間龜類群體的遺傳距離在0.04～0.17之間。其中，烏花雜交龜與烏龜屬遺傳距離最?。?.04），而閉殼龜屬與果龜屬的遺傳距離最小（0.17）。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

用不同的聚類方法和遺傳距離得到NJ樹（圖1）和UPGMA樹（圖2），都采用Kiumra雙因子參數(shù)構建模型。其中NJ樹顯示，閉殼龜屬和鋸緣龜屬先聚為一類，而烏花雜交龜、烏龜屬、花龜屬和擬水龜屬聚為一類，兩者再聚為一大類；然后與眼斑龜屬聚為一大支。齒緣龜屬和果龜屬則聚為一大支。UPGMA樹結果與NJ樹結果相似。

3 小結與討論

3.1 烏花雜交龜和親本的形態(tài)差異與分子標記

烏花雜交龜與其親本差異較為顯著，主要表現(xiàn)在背甲紋路、腹甲黑斑、頭頸部及四肢尾覆面的皮膚顏色。在形態(tài)學上，雜種龜頭部為淺橄欖色，頭部眼后有數(shù)條黃綠色條紋；背甲為淺栗色和黃褐色；腹甲棕黃色，每一盾片具一大塊墨漬狀斑塊；四肢、尾部及裸露皮膚均有數(shù)條成點狀間斷的黃綠色條紋[8]。

Morita等[9]研究報道細胞色素b基因種間的分歧度為1%～10%。一般情況下，分歧度能較好反映出物種的進化速度差異。細胞色素b基因是線粒體基因組上13個蛋白編碼基因之一，進化速率快，變異程度高，因而被認為是探討近緣種間和種內(nèi)遺傳分化程度的良好指標。張永正等[10]利用線粒體DNA細胞色素b基因序列對中華鱉5個不同地理種群遺傳結構進行分析。結果表明，日本群體的兩種單倍型序列上的穩(wěn)定差異，可以成為種群鑒別的分子標記。本研究對烏花雜交龜及其他22種龜鱉類動物的線粒體Cyt b基因全長序列測定表明，共有1 150個位點， 其中變異率為40.70%，這些DNA序列差異可以作為區(qū)分烏花雜交龜與其他龜類的分子標記。

3.2 烏花雜交龜在內(nèi)群中的系統(tǒng)發(fā)生關系

從2個系統(tǒng)發(fā)生樹中，可以看出烏花雜交龜與親本的關系。烏花雜交龜與母本中華草龜?shù)年P系最近，是并系的，而后與父本中華花龜合并成一個單系。賀剛等[8]采用聚類分析從形態(tài)學特征研究表明，烏花雜交龜形態(tài)上接近母本烏龜（中華草龜），本研究從分子生物學角度驗證了這一觀點，這與線粒體DNA母系遺傳的觀點較為一致。

從內(nèi)群不同屬的系統(tǒng)關系來看，烏龜屬、花龜屬和擬水龜屬合并為一大類，且有較高的支持率，而烏花雜交龜明顯屬于這大類中。這與Cyt b基因序列與采用12S rRNA和16S rRNA、SINE基因序列的核DNA的研究結果是一致的[11]，3屬的親緣關系很近，是并系的。張艷云等[12]認為可以將烏龜屬、花龜屬和擬水龜屬合并為同一屬，本研究從分子系統(tǒng)樹的結果支持這一觀點。但在形態(tài)特征如體色、體形和生長性狀等方面來說，烏龜屬、花龜屬和擬水龜屬差異顯著，造成的原因可能是不同環(huán)境選擇壓力下導致物種在形態(tài)上差異[13]。本研究分析了烏花雜交龜?shù)南到y(tǒng)分化特征，但Cyt b基因序列較短，提供的遺傳背景資料有限，還需采用多種分子標記綜合分析，以及更多形態(tài)學、生理學等多學科方面的證實，才能得到更準確的結論。

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（責任編輯 屠 晶）