摘要：利用免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察了小麥（Triticum aestivum L.）灌漿時期穎果內(nèi)以及苗期根部原生韌皮部Cathepsin B-like蛋白的分布以及活性變化。結(jié)果表明，在開花后1～9 d的小麥穎果內(nèi)，Cathepsin B-like蛋白主要分布在內(nèi)果皮細胞以及灌漿池兩側(cè)的維管束中；在開花后12～24 d的穎果中，糊粉層內(nèi)的Cathepsin B-like蛋白含量逐漸增加，兩側(cè)維管束細胞中的Cathepsin B-like蛋白消失，穎果背部內(nèi)果皮細胞的Cathepsin B-like蛋白含量減少并在細胞邊緣出現(xiàn)聚集現(xiàn)象；在小麥苗期根部的原生韌皮部中，隨著韌皮部篩分子的成熟，篩分子內(nèi)的Cathepsin B-like蛋白含量逐漸下降直至消失。

關(guān)鍵詞：Cathepsin B-like蛋白；小麥（Triticum aestivum L.）；穎果；根部；發(fā)育

中圖分類號：S512.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）17-4044-04

Preliminary Research on Cathepsin B-like Protein in Triticum aestivum L.

Caryopsis and Root

LIU Yanga，ZHOU Zhu-qinga，MEI Fang-zhub，ZHOU Guang-shengb，CAI Jing-tonga，YANG Wen-lia，ZHANG Zhi-huia

（a.College of Life Sciences and Technology；b.College of Plant Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

Abstract： Immunohistochemical technique was used to observe the distribution and activity variation of cathepsin B-like protein in wheat（Triticum aestivum L.） caryopsis during grain filling period and protophloem of roots during seedling stage. Results showed that in wheat caryopsis 1～9 d after flowering， cathepsin B-like proteins mainly distributed in vascular bundles of endocarp cells and both sides of grouting tank. In caryopsis 12～24 d after flowering， cathepsin B-like protein gradually increased in aleurone layer， while disappeared in both sides of vascular bundles， and reduced in endocarp cells of caryopsis back and concentrated in periphery of cells. In protophloem of roots at seedling stage， cathepsin B-like proteins gradually decreased in sieve elements（SEs） and finally disappeared as SEs matured.

Key words： cathepsin B-like protein； wheat（Triticum aestivum L.）； caryopsis； root； development

收稿日期：2013-02-01

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31171469；31071347）

作者簡介：劉 陽（1985-），男，河南鞏義人，碩士，研究方向為逆境植物細胞生物學(xué)，（電話）15527830798（電子信箱）zhuoya472@126.com；

通信作者，周竹青（1965-），男，湖北安陸人，教授，博士，從事作物生理與細胞生物學(xué)研究，（電子信箱）zhouzhuqing@mail.hzau.edu.cn。

哺乳動物中廣泛存在著一類被稱作Cathepsin B的蛋白酶[1]，它是木瓜蛋白酶類超家族中的一員[2]，一般存在于動物細胞的溶酶體中[3]。Johnson[4]指出Cathepsin B可能在一些細胞凋亡過程中發(fā)揮某種特殊作用。在該類凋亡過程中，常見的Caspase類蛋白無法達到預(yù)期目的。Leist等[3]指出Cathepsin B是一種在動植物中高度保守的Papain-like半胱氨酸蛋白酶。Cejudo等[5]在小麥（Triticum aestivum L.）中發(fā)現(xiàn)了一個與Cathepsin B蛋白結(jié)構(gòu)具有高度相似性的蛋白質(zhì)，并在萌發(fā)小麥的糊粉層中觀察到了該Cathepsin B-like蛋白對應(yīng)mRNA的積累，該Cathepsin B-like蛋白受GA調(diào)節(jié)，其在植物細胞中的作用目前還不確定。但目前為止對灌漿期內(nèi)小麥穎果以及苗期小麥根部原生韌皮部中Cathepsin B-like蛋白的分布及活性變化尚未見報道。本研究通過對小麥穎果與根部發(fā)育過程中Cathepsin B-like蛋白分布以及活性變化進行觀察，以期為小麥發(fā)育過程的系統(tǒng)研究進一步提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以小麥品種華麥8號為材料，溫室培養(yǎng)，室溫18 ℃。小麥開花當(dāng)天掛牌標(biāo)記開花麥穗，用記號筆點穎的方法標(biāo)記穗中部開花小穗。在開花后不同時間段選取標(biāo)記小穗第一、第二粒位穎果作為試驗材料。另外取適量種子，蒸餾水清洗后以1%～3% H2O2處理5 min。蒸餾水清洗2～3遍后水中浸泡3 h。將吸足水分的種子在鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)，3～5 d后取根尖包括根冠在內(nèi)約7 mm的區(qū)段進行石蠟包埋。

1.2 方法

將取得的根尖以及穎果材料用含有甘油的FAA固定8 h左右，石蠟包埋、切片，切片厚度7～10 μm。石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗后用PBS浸泡5 min。3% H2O2室溫孵育5～10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS沖洗，3 min×3次。5%～10%正常羊血清進行封閉，室溫下孵育10 min。孵育后傾去血清，勿沖洗，滴加適當(dāng)比例（1∶100）稀釋后的一抗（Santa Cruz），4 ℃下過夜。PBS沖洗，3 min×3次。滴加適當(dāng)比例（1∶100）稀釋過的生物素標(biāo)記的二抗（1% BSA-PBS稀釋），37 ℃下孵育10～30 min。PBS沖洗，3 min×3次。滴加適當(dāng)比例（1∶100）稀釋過的辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素（1% BSA-PBS稀釋），37 ℃下孵育10～30 min。PBS沖洗，3 min×3次。之后DAB（北京中杉金橋生物技術(shù)公司生產(chǎn)的DAB顯色試劑盒）顯色。最后用自來水充分沖洗，脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。以血清孵育后不滴加一抗為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Cathepsin B-like蛋白在穎果中的分布與變化

2.1.1 Cathepsin B-like蛋白在糊粉層與內(nèi)果皮中的分布與變化 在開花后1 d的小麥穎果中（圖1A），內(nèi)果皮細胞開始在灌漿池外緣出現(xiàn)；該時期的內(nèi)果皮細胞尚未出現(xiàn)伸長現(xiàn)象，胞內(nèi)有強烈的Cathepsin B-like蛋白免疫陽性反應(yīng)，同時期的果皮細胞只有零星陽性反應(yīng)；糊粉層在該時期尚未形成。在開花后3 d的穎果中（圖1B），內(nèi)果皮細胞仍然未出現(xiàn)伸長，胞內(nèi)有強烈的Cathepsin B-like蛋白免疫陽性反應(yīng)；此時的果皮中只有零星細胞的細胞核還保持完整，核內(nèi)有一定強度的陽性信號；糊粉層開始形成，但形態(tài)特征不明顯。開花后9 d的穎果中（圖1C），內(nèi)果皮細胞開始伸長，胞內(nèi)出現(xiàn)強烈的Cathepsin B-like蛋白陽性信號；此時果皮細胞的情況與開花后3 d時類似；糊粉層形成，細胞形狀規(guī)則，細胞核中有一定強度的Cathepsin B-like蛋白陽性信號，該信號的強度和含量都低于內(nèi)果皮細胞。在開花后12 d的穎果中（圖1D），內(nèi)果皮細胞繼續(xù)伸長，胞內(nèi)Cathepsin B-like蛋白陽性信號強烈，分布均勻；果皮細胞中的細胞核已基本解體，細胞質(zhì)皺縮，只有少量陽性信號反應(yīng)；糊粉層中的Cathepsin B-like蛋白陽性信號開始增強，其在糊粉層細胞中的分布已不局限于細胞核，而是均勻分布在整個細胞中，信號強度低于內(nèi)果皮細胞。開花后14 d的穎果中（圖1E），內(nèi)果皮細胞的形狀開始變得不規(guī)則，胞內(nèi)Cathepsin B-like蛋白陽性信號強烈，分布不均勻，開始向細胞邊緣收縮聚集；果皮細胞的胞內(nèi)物質(zhì)已基本解體，觀察不到陽性信號；糊粉層細胞內(nèi)Cathepsin B-like蛋白陽性信號的強度和分布與開花后12 d時類似。開花后16 d的穎果中（圖1F），內(nèi)果皮、果皮細胞中的陽性信號強度和分布與開花后14 d時類似，糊粉層中的陽性信號強度繼續(xù)增強。開花后18 d的穎果中（圖1G），內(nèi)果皮細胞的陽性信號只分布在細胞的邊緣區(qū)域，糊粉層細胞陽性信號強度繼續(xù)增強，強度與內(nèi)果皮細胞中的信號一致。開花后24 d的穎果中（圖1H），內(nèi)果皮細胞的陽性信號主要分布在細胞的邊緣區(qū)域，強度和含量均有所下降，糊粉層細胞陽性信號強度超過內(nèi)果皮細胞。圖1I為不加一抗的對照。

2.1.2 Cathepsin B-like蛋白在穎果維管束中的分布與變化 在開花后1 d小麥穎果的兩側(cè)維管束中（圖2A），薄壁細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均有Cathepsin B-like蛋白的免疫陽性信號，其中細胞核內(nèi)的陽性信號強于細胞質(zhì)；在開花后6 d的穎果兩側(cè)維管束中（圖2B），薄壁細胞胞質(zhì)中的陽性信號已觀察不到，只有核中還有較為強烈的陽性信號；在開花后9 d的穎果兩側(cè)維管束中（圖2C），薄壁細胞的細胞質(zhì)和細胞核中均已沒有陽性信號。在之后的發(fā)育過程中則觀察不到明顯的穎果兩側(cè)維管束。

在開花后1 d的穎果背部維管束中（圖2D），陽性信號較弱，且沒有明顯的特異性；在開花后14 d的穎果背部維管束中（圖2E），合點細胞和木質(zhì)部薄壁細胞中出現(xiàn)了強于周邊細胞的Cathepsin B-like蛋白陽性信號；在開花后24 d（圖2F）的穎果背部維管束中，合點細胞內(nèi)的陽性信號開始消失，而木質(zhì)部薄壁細胞中依舊保留有一定的Cathepsin B-like蛋白陽性信號。

2.2 Cathepsin B-like蛋白在根部原生韌皮部篩分子中的分布與變化

在距根尖頂端343 μm處的根部組織中（圖3A），原生韌皮部篩分子與其伴胞內(nèi)均有強烈的Cathepsin B-like蛋白陽性信號，該信號在篩分子與伴胞中的分布相對均勻，強度與周圍細胞一致；在距根尖頂端427 μm處的組織中（圖3B），原生韌皮部篩分子內(nèi)陽性信號的分布開始收縮，強度與伴胞和周圍細胞中的信號強度一致；在距根尖頂端462 μm處的組織中（圖3C），原生韌皮部篩分子內(nèi)的陽性信號分布變化不大，但強度開始衰弱；在距根尖頂端525 μm處的組織中（圖3D），原生韌皮部篩分子內(nèi)只能觀察到微弱的陽性信號；在距根尖頂端602 μm處的組織中（圖3E），原生韌皮部篩分子內(nèi)已觀察不到任何陽性信號反應(yīng)，伴胞內(nèi)的陽性信號仍然比較強烈，與周圍細胞的信號強度一致；在距根尖頂端889 μm處的根部組織中（圖3F），原生韌皮部周圍薄壁細胞的陽性信號開始消失，伴胞內(nèi)可以觀察到較強的陽性信號。

3 小結(jié)與討論

本試驗研究結(jié)果顯示，在小麥穎果內(nèi)果皮、糊粉層、穎果兩側(cè)維管束、穎果合點細胞、穎果背部木質(zhì)部導(dǎo)管以及根部原生韌皮部篩分子的發(fā)育過程中都有Cathepsin B-like蛋白的參與。這些部位的細胞均已被證實發(fā)生了細胞程序性死亡過程（Programmed cell death，PCD）。Vercher等[6]在豌豆中觀察到內(nèi)果皮細胞在發(fā)育過程中有伸長現(xiàn)象，在伸長過程中，細胞質(zhì)密度下降，液泡增大，并發(fā)生了一系列退化事件，包括質(zhì)體丟失、高爾基體退化等現(xiàn)象，最終胞內(nèi)內(nèi)含物消失，細胞死亡，形成厚壁組織。糊粉層由胚乳的表層細胞發(fā)育轉(zhuǎn)化而來，在子粒的萌發(fā)過程中，胚會釋放出赤霉素，誘導(dǎo)糊粉層產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶等水解酶類，分解胚乳中蛋白質(zhì)和淀粉等物質(zhì)[7]，為胚的生長提供養(yǎng)分，之后糊粉層則發(fā)生程序性細胞死亡[8，9]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，小麥韌皮部篩分子發(fā)育過程中細胞器發(fā)生有序解體，同時檢測到呈TUNEL陽性反應(yīng)的細胞核，還有細胞核降解等一系列細胞學(xué)事件[10]，與經(jīng)典的植物細胞PCD特征類似[11]，說明篩分子發(fā)育是一種PCD過程；木質(zhì)部導(dǎo)管的形成也已被證明屬于典型的PCD過程[12，13]。Kladnik等[14]通過DAPI、TUNEL檢測以及電子顯微鏡觀察證實，玉米合點細胞的發(fā)育過程中出現(xiàn)了DNA片段化、質(zhì)膜解體等PCD特征，并推測該過程可能與木質(zhì)部導(dǎo)管的PCD過程類似。

本試驗結(jié)果顯示，在上述組織細胞發(fā)生PCD之前，其細胞內(nèi)的Cathepsin B-like蛋白陽性信號在分布和強度上都會達到一個高峰期，該時期的Cathepsin B-like蛋白陽性信號在細胞內(nèi)均勻分布，信號反應(yīng)強烈。隨著PCD進程的開始，陽性信號在細胞內(nèi)的分布減少，信號強度逐漸減弱直至消失，推測Cathepsin B-like蛋白含量和活性的變化對PCD進程的推進產(chǎn)生了影響。糊粉層的PCD進程在種子萌發(fā)期開始，將在以后進一步研究。

在由無血清培養(yǎng)引起的PC12細胞的凋亡過程中，過表達Cathepsin B的細胞增強了生存活力；而CA074（Cathepsin B的特異性抑制劑）或者Cathepsin B的反義寡核苷酸片段可以引起細胞的主動死亡。這些結(jié)果表明細胞中可能存在一條由Cathepsins調(diào)節(jié)的細胞死亡途徑，而Cathepsin B則抑制了該死亡，增強了細胞活性[2]。

張文虎[15]認為糊粉層中貯存著大量的脂類物質(zhì)，細胞壁較厚，細胞之間緊密排列并具有生命活性，可以對微小的環(huán)境變化做出相應(yīng)反應(yīng)，從而維持胚乳營養(yǎng)成分長期不變。糊粉層的這種作用要求糊粉層細胞在種子萌發(fā)之前的相當(dāng)長時間內(nèi)都保持細胞活性。筆者在糊粉層的發(fā)育過程中觀察到了Cathepsin B-like蛋白的增加和積累，從這一個方面也證實了Cathepsin B-like蛋白抑制細胞的程序性死亡，維持細胞活性的推論。結(jié)合以上結(jié)果和分析，推測Cathepsin B-like蛋白具有維持細胞活性、推遲PCD進程的作用。隨著其在細胞中含量和活性的減少，植物發(fā)育所需的PCD進程才得以推進。

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