羅明亮，申愛(ài)榮，蔣麗娟

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

生物酶的選擇對(duì)水酶法提取蓖麻油的影響

羅明亮1，申愛(ài)榮2，蔣麗娟1

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

研究了纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、中性蛋白酶和半纖維素酶單因素及其復(fù)配酶對(duì)提取蓖麻籽總油和清油提取率的影響。結(jié)果表明：在試驗(yàn)的5種單酶中，以中性蛋白酶為水解酶的提油效果最好，其總油提取率和清油提取率最高，分別達(dá)到了91.17%和62.11%；最佳提取條件為加酶量3%（重量比）、料液比1︰4（質(zhì)量體積比）、反應(yīng)溫度50℃、酶解時(shí)間4 h、pH 值6.8；復(fù)配酶中，中性蛋白酶+果膠酶的總油提取率最高，為86.93%，而中性蛋白酶+纖維素酶的清油提取率最高，為40.62%。

蓖麻油；水酶法提取；中性蛋白酶；復(fù)配酶；單因素實(shí)驗(yàn)

水酶法是以機(jī)械和酶解為手段降解植物細(xì)胞壁，使油脂釋放。在水溶劑應(yīng)用基礎(chǔ)上，采用纖維素酶、半纖維素酶或果膠酶等生物酶制劑來(lái)破壞油料的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，可有效提高油料蛋白和油脂的提取率[1-2]。與傳統(tǒng)工藝相比，生物酶法提油具有諸多優(yōu)點(diǎn)：油脂得率高，毛油品質(zhì)好，易于后續(xù)精煉；工藝路線和技術(shù)設(shè)備簡(jiǎn)單，能耗低；操作條件溫和，可同時(shí)回收油脂和蛋白質(zhì)，資源的綜合利用率高[3]。同時(shí)，水酶法提油所產(chǎn)生的廢水BOD和COD下降30%～40%，有利于環(huán)境保護(hù)和油脂工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

橄欖油、椰子油、菜籽油、米胚油、玉米胚芽油、花生油、大豆油等油料的水酶法提取國(guó)內(nèi)外已有相關(guān)研究報(bào)道[4-9]，研究者在酶法提取油脂的工藝研究方面做了大量工作，已取得了重要的進(jìn)展。就目前的研究現(xiàn)狀而言，對(duì)于不同的油料和研究條件，研究結(jié)果存在很大的差異，為了進(jìn)一步促進(jìn)新的發(fā)展，有必要進(jìn)行更深入的研究。

蓖麻Ricinus communis 為世界十大油料作物之一，其種子油脂主要成分是12-羥基十八烯酸甘油酯，約占90%，是自然界中羥價(jià)很高的油脂，性質(zhì)獨(dú)特，具有其它油脂所不及的特性：粘度高，凝固點(diǎn)低，既耐嚴(yán)寒又耐高溫，廣泛用于化工、輕工、冶金、機(jī)電、紡織、印刷等工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)，也是植物油中寶貴的工業(yè)用油[10-12]。

蓖麻油現(xiàn)行的工業(yè)制備工藝為預(yù)榨—浸出法，運(yùn)用冷榨法提取部分油脂，再運(yùn)用化學(xué)溶劑浸出殘?jiān)械氖Ｓ嘤椭?。預(yù)榨—浸出法在生產(chǎn)中存在溶劑價(jià)格昂貴、溶劑易揮發(fā)損失、有機(jī)溶劑易燃易爆造成環(huán)境污染和安全隱患等缺點(diǎn)。運(yùn)用水酶法提取蓖麻油，可以保持蓖麻籽中蛋白質(zhì)活性，綜合利用蓖麻籽中的油脂和毒蛋白資源，具有良好的發(fā)展前景。在水酶法提取油脂的工藝中，酶的選擇是影響結(jié)果的重要因素。本文中主要研究不同的酶種類及酶解條件對(duì)水酶法提取蓖麻油的影響，以期為蓖麻油的水酶法生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為蓖麻的精深加工和綜合利用提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料及試劑

蓖麻種子：湘蓖一號(hào)采自湖南省林科院試驗(yàn)林場(chǎng)，曬干保存，含水量為6.33%。

試劑：纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、中性蛋白酶、半纖維素酶，均購(gòu)自上海楷洋生物技術(shù)有限公司；其余試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器、設(shè)備

主要儀器有：電熱恒溫水浴鍋、電子分析天平、電動(dòng)攪拌機(jī)、高速大型離心機(jī)、酸度計(jì)、脂肪測(cè)定儀。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蓖麻果仁和提油后殘?jiān)泻吐实臏y(cè)定

含油率的測(cè)定按照索氏抽提法[13]。

1.3.2 水酶法提取蓖麻油的過(guò)程

參照申愛(ài)榮等[14]的水酶法提取工藝，即種子→清理（去種皮）→破碎（磨漿）→滅酶→冷卻→酶解→離心分離→清油 。

1.3.3 酶的選擇對(duì)水酶法提取蓖麻油的影響

稱取100 g粉碎的剝殼蓖麻果實(shí)，加入相應(yīng)料液比0.025 mol/L的磷酸緩沖液浸泡后,于恒溫（100℃）水浴鍋連續(xù)攪拌10 min，高溫滅酶，待料溫降到酶解所需溫度時(shí)，調(diào)節(jié)pH值，加入一定量酶，攪拌，酶解反應(yīng)一定時(shí)間，靜置分層，在4 000 r/min條件下離心分離油脂10 min，獲取上層清油并稱其質(zhì)量，再收集殘?jiān)瑴y(cè)定殘?jiān)械暮土?，根?jù)公式計(jì)算提油率。

Cf=Mf/(Mc×Co)×100%。

式中：Cf為清油提油率；Mf為清油質(zhì)量；Mc為蓖麻種仁質(zhì)量；Co為蓖麻含油率。

Ct=(Mc×Co-Mr)/(Mc×Co)×100%。

式中：Ct為總油提取率；Mc為蓖麻種仁質(zhì)量；Co為蓖麻含油率；Mr為殘?jiān)土俊?/p>

1.3.4 2種酶復(fù)配對(duì)提取蓖麻油的影響

從纖維素酶、果膠酶、中性蛋白酶、半纖維素酶中分別選取2種酶，按上述方法同時(shí)加入反應(yīng)物中，研究2種酶復(fù)配對(duì)水酶法提油率的影響。酶總用量為3%，選取的2種酶用量各為1.5%，酶解反應(yīng)時(shí)間為4 h，pH值和溫度分別為各酶適宜反應(yīng)范圍之最佳近似點(diǎn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酶對(duì)蓖麻油提取的影響

選取纖維素酶、果膠酶、淀粉酶、中性蛋白酶、半纖維素酶在料液比為1∶3（質(zhì)量體積比）、酶量為2%（重量比）、反應(yīng)時(shí)間4 h、pH值和溫度為各酶適宜范圍的條件下進(jìn)行水酶法提取蓖麻油，實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖1）表明，在相同條件下，中性蛋白酶提取蓖麻油的效果最佳，總油提取率和清油提取率分別達(dá)到了82.22%和43.04%；效果最差的是淀粉酶，提取率分別是64.06%和21.31%；其余4種酶按提油率高低排序，依次為果膠酶、半纖維素酶、纖維素酶和淀粉酶。

圖1 不同酶對(duì)提油率的影響Fig. 1 Effects of different enzymes on oil extraction rate

蓖麻破碎后阻礙油脂釋放的主要因素是油脂與蛋白質(zhì)之間的親和力，油脂中蛋白質(zhì)的適當(dāng)破壞即有利于油料提取通道的打開(kāi)[15-16]。本研究中性蛋白酶的清油提取率較高的原因可能是蛋白酶滲透到脂質(zhì)體膜內(nèi)，以及酶對(duì)脂多糖、脂蛋白的分解作用，有利于油脂從復(fù)合體中釋放。

鑒于中性蛋白酶的良好提油效果，選擇中性蛋白酶作為后續(xù)研究用酶，采用單因素分析法研究中性蛋白酶提取蓖麻油的最佳工藝條件。

2.2 中性蛋白酶酶量對(duì)蓖麻油提取的影響

在溫度45 ℃、料液比1∶3、pH值6.8、反應(yīng)時(shí)間4 h的條件下，研究了不同酶用量對(duì)提油率的影響，結(jié)果（如圖2所示）表明，隨著酶用量的增加，總油提取率和清油提取率都有不同程度上升。對(duì)于總油提取率而言，中性蛋白酶加酶量在2.5%時(shí)，提取率已經(jīng)達(dá)到87.22%，繼續(xù)增加酶的用量，提油率上升趨于平緩。對(duì)于清油提取率，隨著酶用量的增加，提油率呈升高趨勢(shì)：當(dāng)酶用量達(dá)到3%時(shí)，提油率的上升到最高，并逐漸趨于平緩；酶用量為3%時(shí)，清油提油率達(dá)到51.50%。綜合考慮提油率和成本，后續(xù)試驗(yàn)的酶用量確定為3%。

圖2 加酶量對(duì)提油率的影響Fig. 2 Effects of enzyme dosages on oil extraction rate

2.3 料液比對(duì)蓖麻油提取的影響

在溫度45℃、加酶量3%、pH值6.8、反應(yīng)時(shí)間4 h的條件下，分別調(diào)節(jié)料液比（1∶2、1∶3、1∶4、1∶5和1∶6），研究不同料液比對(duì)提油率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖3所示）表明，總油提取率和清油提取率在料液比為1∶4條件下達(dá)到最高。料液比主要通過(guò)兩個(gè)方面影響酶的活力：反應(yīng)體系的流動(dòng)性和酶的濃度。在低料液比情況下，反應(yīng)體系流動(dòng)性差，不利于酶與物料接觸；但當(dāng)料液比過(guò)高時(shí)，較低的酶濃度和底物濃度不利于發(fā)揮中性蛋白酶活性。所以，最適料液比為1∶4。

2.4 酶解反應(yīng)時(shí)間對(duì)蓖麻油提取的影響

圖3 料液比對(duì)提油率的影響Fig. 3 Effects of solid-liquid ratio on oil extraction rate

在溫度45℃、加酶量3%、pH值6.8、料液比為1∶4的條件下，研究不用酶解反應(yīng)時(shí)間（2、4、6、8 h）對(duì)提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖4所示）表明，酶解反應(yīng) 4 h油的提取率達(dá)到最高；4 h后，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，油的提取率呈略微下降趨勢(shì)。酶解時(shí)間的長(zhǎng)短決定了酶對(duì)底物的作用程度。在反應(yīng)前期，較高濃度的底物，酶的作用有利于細(xì)胞結(jié)構(gòu)打開(kāi)，促進(jìn)油脂與其它結(jié)合物質(zhì)分離，從而提高出油率。所以，酶解反應(yīng)時(shí)間為4 h。

圖4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)提油率的影響Fig. 4 Effects of hydrolysis time on oil extraction rate

2.5 酶解反應(yīng)溫度對(duì)蓖麻油提取的影響

在加酶為3%、pH值6.8、料液比1∶4、酶解反應(yīng)4 h的條件下，分別調(diào)節(jié)不同的反應(yīng)溫度，研究酶解反應(yīng)溫度對(duì)油提取率的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖5所示）表明，以50 ℃為界，在40～50℃之間，提油率隨著溫度升高而升高，但是超過(guò)50 ℃，出油率開(kāi)始下降。溫度既影響物料的分子運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散作用，又會(huì)影響酶的活性。在一定范圍內(nèi)，溫度的升高可以增加分子運(yùn)動(dòng)和擴(kuò)散作用，提高反應(yīng)速度；當(dāng)溫度超過(guò)酶的最適溫度，又會(huì)影響酶的中心結(jié)構(gòu)，降低酶的催化活性。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，反應(yīng)溫度宜選擇50 ℃。

圖5 反應(yīng)溫度對(duì)提油率的影響Fig. 5 Effects of hydrolysis temperature on oil extraction rate

2.6 酶解反應(yīng)pH值對(duì)蓖麻油提取的影響

pH值主要影響酶的活性，同時(shí)影響油與植物蛋白分離提取，是一個(gè)十分重要的工藝參數(shù)[17]。因而過(guò)酸或過(guò)堿都不利于酶反應(yīng)過(guò)程。在加酶量3%、反應(yīng)溫度50℃、料液比1∶4、酶解反應(yīng)4 h的條件下，分別調(diào)節(jié)不同的pH值，研究酶解反應(yīng)pH值對(duì)油提取的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（如圖6所示）表明，當(dāng)pH值為6.8時(shí)，油的提取率最高，總油提取率達(dá)到91.17%，清油提取率達(dá)到62.11%。本實(shí)驗(yàn)采用的是中性蛋白酶，在pH值接近中性的條件下，酶的活性最高，因而提油率也最高。

圖6 pH值對(duì)提油率的影響Fig. 6 Effects of pH value on oil extraction rate

2.7 復(fù)合酶對(duì)蓖麻油提取的影響

在總加酶量、料液比為1∶4條件下，復(fù)合酶的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，在5種復(fù)合酶反應(yīng)體系中，總油提取率以中性蛋白酶+果膠酶最高，達(dá)到86.93%；而清油提取率最高的則是中性蛋白酶+纖維素酶，為40.62%。一些研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)合酶能夠更好地瓦解細(xì)胞壁，提高油料的提取率，比單酶的使用效果好[18-19]。而本實(shí)驗(yàn)2種酶復(fù)配的條件下，無(wú)論是總油提取率還是清油提取率，復(fù)合酶的提油率都低于只使用中性蛋白酶酶解提油，對(duì)影響復(fù)配酶提油效果的因素以及3種以上酶復(fù)配對(duì)提取蓖麻油的影響還有待進(jìn)一步試驗(yàn)。

圖7 復(fù)合酶對(duì)提油率的影響Fig. 7 Effects of complex enzyme on oil extraction rate

3 結(jié) 論

酶的選擇與油料密切相關(guān)。王小英等[20]將超聲波法和水酶法提油技術(shù)相結(jié)合，通過(guò)堿性蛋白酶酶解，小麥胚芽提油率可達(dá)82.20%。在玉米胚油提取實(shí)驗(yàn)中，王素梅[21]以2%纖維素酶進(jìn)行酶解反應(yīng),游離油得率提高到83%。劉志強(qiáng)等[22]利用纖維素酶進(jìn)行花生提油，油脂提取率可以達(dá)到95.4%。申愛(ài)榮等[13]利用纖維素酶提取光皮樹(shù)油，優(yōu)化后提油率達(dá)到76.64%。Rosenthal[23]發(fā)現(xiàn)纖維素酶與蛋白酶作用提取大豆油效果較好, 油得率為58.7%。Lanzani等人[24]發(fā)現(xiàn)在果膠酶與蛋白酶混合酶組成作用下，油得率提高到78%。

本研究結(jié)果表明采用單一酶和復(fù)合酶提取蓖麻油，不同酶的種類對(duì)提油率影響差異較大， 主要是影響清油的提取率。使用單一中性蛋白酶，清油提取率明顯高于其它酶。該酶在加酶量3%、料液比1∶4、反應(yīng)溫度50℃、酶解時(shí)間4 h、pH 值6.8的條件下，總油提取率和清油提取率分別達(dá)到91.17%和62.11%。其原因可能是：其一，蓖麻籽經(jīng)過(guò)剝殼處理后，無(wú)殼種子的組織容易破碎，細(xì)胞壁中纖維素、半纖維素含量較低，有利于提高油脂提取率；其二，蓖麻油主要成分為90%的12-羥基-十八烯酸甘油酯，羥基的存在使其極易與水、蛋白質(zhì)等形成乳化體系，而中性蛋白酶對(duì)乳化體系具酶解能力，通過(guò)分解蛋白質(zhì)達(dá)到破乳效果，從而提高清油得率。

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Effects of different enzymes and other factors on aqueous enzymatic extraction of castor oil

LUO Ming-liang1, SHEN Ai-rong2, JIANG Li-juan1
(1.Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China)

Aqueous enzymatic extraction of castor oil was investigated. The optimum enzyme was chosen from cellulase, pectinase,amylase, natural protease, hemicellulase. The results show that the natural protease was the best enzyme with the highest total oil extraction rate and the highest free oil extraction rate. Furthermore, the optimum conditions of natural protease was obtained by single factor test, which were as followings: dosage of the enzyme 3%, temperature 50℃, ratio of material to water 1︰4, hydrolysis time 4 hours, pH value 6.8. Under these conditions, the total oil extraction rate and the free oil extraction rate could reached by 91.17% and 62.11%. Among the mixed enzymes, the natural protease mixed with pectinase had the highest total oil extraction rate of 86.93%, and the natural protease mixed with cellulase had the highest free oil extraction rate of 40.62%.

castor oil; aqueous enzymatic extraction; natural protease; compound enzyme; single factor test

S759.4

A

1673-923X(2013)09-0055-05

2012-12-25

國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目“植物油脂生物精煉關(guān)鍵技術(shù)的引進(jìn)”（2010-4-22）

羅明亮（1985-），男，廣東汕頭人，碩士研究生，研究方向?yàn)槟茉粗参锱嘤c利用；E-mail: bright0916@163.com通訊作者：蔣麗娟（1965-），女，湖南道縣人，教授，博士，博士研究生導(dǎo)師，主要從事能源植物培育與利用研究；

E-mail:znljiang2542@yahoo.cn

[本文編校：謝榮秀]