閆憲剛 仇萬山 賈 兵

·論著·

亞細(xì)亞酸對兔未成熟肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

閆憲剛 仇萬山 賈 兵

目的 觀察亞細(xì)亞酸對兔未成熟肺缺血再灌注損傷的保護(hù)作用。方法 選用15 ～ 21日齡新西蘭白兔60只，分為5組：假手術(shù)組，對照組，亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組，每組各12只。建立單肺缺血再灌注模型，肺門阻斷1 h后，開放再灌注4 h。亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組分別于術(shù)前3 d給予亞細(xì)亞酸7.5、15和30 mg·kg-1,假手術(shù)組僅開胸不阻斷肺門，對照組不予干預(yù)。術(shù)畢收集肺組織，光鏡和電鏡觀察肺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變。測定肺組織丙二醛(MDA)，細(xì)胞毒性活性氧(ROS)-HR、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平。Western Blot檢測髓樣生化因子(MyD)88和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)水平。ELISA法檢測IL-1β、TNF-α水平。結(jié)果 ①亞細(xì)亞酸中和高劑量組肺缺血再灌注損傷明顯減輕，光鏡下肺泡與肺泡間隔腫脹程度明顯輕于對照組，肺泡腔滲液減少，出血少見。電鏡下可見肺泡上皮與血管內(nèi)皮細(xì)胞脫落明顯減少。②亞細(xì)亞酸中和高劑量組較對照組肺組織MDA，ROS-HR水平明顯降低，SOD及GSH-PX水平明顯升高；各時(shí)點(diǎn)的IL-1β、TNF-α水平也有不同程度下降，特別是再灌注后的2 h和4 h(P<0.05)；肺組織中MyD88和NF-κB表達(dá)顯著下降。③亞細(xì)亞酸中和高劑量的保護(hù)效果較好。結(jié)論 亞細(xì)亞酸對未成熟肺缺血再灌注損傷有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制與清除氧自由基和減輕全身炎性反應(yīng)有關(guān)。

幼兔； 缺血再灌注; 肺損傷； 亞細(xì)亞酸

隨著外科技術(shù)和圍術(shù)期監(jiān)護(hù)技術(shù)的提高，先天性心臟病(CHD)的手術(shù)趨于低齡化，但體外循環(huán)心內(nèi)直視手術(shù)后肺缺血再灌注損傷，仍是臨床常見的并發(fā)癥，急性肺損傷的發(fā)生率為15%～30%[1]，重癥病死率達(dá)15% ～ 50%[2]。特別對于新生兒和嬰幼兒CHD術(shù)后未成熟肺缺血再灌注損傷的發(fā)生率更高，程度更嚴(yán)重，是影響預(yù)后的最常見因素[3，4]，因此肺保護(hù)一直是心臟外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。亞細(xì)亞酸(asiatic acid)是積雪草提取物中的五環(huán)三菇烯類組分，具有抗炎和抗損傷作用[5]。國外學(xué)者已證實(shí)亞細(xì)亞酸對腦局灶性缺血再灌注損傷有一定保護(hù)作用[6]，尚未見對未成熟肺保護(hù)作用的報(bào)道。故本研究建立幼兔肺缺血再灌注模型，觀察亞細(xì)亞酸是否可以減輕肺缺血再灌注損傷，探討一種新的針對未成熟肺的保護(hù)方法，為改善嬰幼兒CHD外科預(yù)后提供理論上的依據(jù)。

1 方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 相同遺傳背景的15～21日齡新西蘭兔60只(體重0.6～0.8 kg)，上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所提供，提前1周送至本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)房喂養(yǎng)，以適應(yīng)環(huán)境(溫度22℃，濕度60%)。

1.2 分組和干預(yù) 分為5組：假手術(shù)組，對照組，亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組，每組各12只。參照Skauma等[7]方法建立單肺缺血再灌注損傷模型：禁食12 h，戊巴比妥鈉15 mg·kg-1靜脈麻醉，左側(cè)臥位，經(jīng)右前外側(cè)切口，第5肋間進(jìn)胸，顯露右側(cè)肺門，分離動(dòng)脈、靜脈及支氣管。靜脈注射肝素200 U·kg-1，5 min后用18號小彎無損傷鉗，阻斷右肺門1 h后再開放。假手術(shù)組僅開胸，不阻斷肺門。亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組分別于建模前3 d喂服亞細(xì)亞酸(純度95%，批號84696-21-9，廣西昌洲天然產(chǎn)物開發(fā)有限公司)7.5、15和30 mg·kg-1，對照組不給予干預(yù)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 炎性因子水平 各組于開放肺門(再灌注)前、開放(再灌注)后1、2和4 h采集血樣，ELISA法檢測各時(shí)點(diǎn)IL-1β和TNF-α水平，試劑盒由上海希美生物科技有限公司提供。

1.3.2 丙二醛(MDA)、細(xì)胞毒性活性氧(ROS)-HR、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)水平測定 各組于術(shù)畢收集右下肺葉，稱取肺組織200 mg，按重量體積比加入9倍的生理鹽水制成10%的組織勻漿，2500 r·min-1離心10 min，取上清液再用生理鹽水稀釋成0.1%的勻漿，ELISA法測定MDA、ROS、DOS和GSH-PX水平，試劑盒由南京建成生物研究所提供。

1.3.3 髓樣分化因子(MyD)88和核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)水平測定 各組于術(shù)畢收集右下肺葉，采用全細(xì)胞蛋白抽提試劑盒提取肺組織細(xì)胞內(nèi)蛋白。取50 μg 蛋白，95℃變性 5 min，以Western-blot法進(jìn)行蛋白電泳，分別加入兔抗鼠 MyD88和NF-κB、Lamin B、β-actin一抗，4℃過夜；洗膜3次，加入 HRP 標(biāo)記二抗，37℃孵育1 h，洗膜 3 次；用 Odyssey紅外熒光掃描機(jī)成像系統(tǒng)進(jìn)行掃膜。采用Bandscan 5. 0軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度值分析，以目的條帶與β-actin、Lamin B內(nèi)參照條帶的比值代表蛋白的表達(dá)水平。每一個(gè)條帶代表3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

1.3.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)和血?dú)庵笜?biāo) 各組于缺血再灌注后2 h時(shí)點(diǎn)采集血樣，行血?dú)夥治龊脱鲃?dòng)力學(xué)指標(biāo)分析。

1.3.5 肺組織病理和超微結(jié)構(gòu)改變 各組取右肺下葉組織2塊，1塊以10%甲醛室溫下固定18 h，乙醇梯度脫水，石蠟包埋，制成厚4 μm的切片，蘇木精-伊紅染色，光鏡觀察；另一塊組織快速固定于2.5%的冷戊二醛液2 h，1%鋨酸再固定1 h，丙酮梯度脫水，Epon-812樹脂包埋，半薄切片定位與肺泡結(jié)構(gòu)，70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重電子染色，JEM-1200透射電鏡觀察。

2 結(jié)果

2.1 死亡率 假手術(shù)組、對照組、亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組分別有1、6、4、3和4只兔死亡。

2.2 各組肺組織MDA，ROS-HR水平比較 表1顯示，對照組ROS-HR和MDA水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，亞細(xì)亞酸中、高劑量組ROS-HR和MDA水平顯著低于對照組(P<0.05)；亞細(xì)亞酸低劑量組ROS-HR和MDA水平與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。亞細(xì)亞酸三個(gè)劑量組中，中劑量組ROS-HR和MDA水平最低。

2.3 各組肺組織SOD、GSH-PX水平比較 如表1所示，對照組肺組織線粒體SOD和GSH-PX水平顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，亞細(xì)亞酸中劑量組SOD水平和GSH-PX活性顯著高于對照組(P<0.05)，亞細(xì)亞酸低、高劑量組SOD水平和GSH-PX活性與對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 各組肺組織MyD88和NF-κB表達(dá)水平比較 圖1和表1顯示，對照組肺組織線粒體MyD88和NF-κB水平顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，亞細(xì)亞酸低、中、高劑量組MyD88和NF-κB水平顯著低于對照組(P均<0.05)。

2.5 各組血漿TNF-α和IL-1β水平比較 圖2顯示，對照組再灌注前、再灌注后1、2、4 h TNF-α和IL-1β水平均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，于再灌注后2 h達(dá)峰值，之后略有下降。再灌注前：亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組IL-1β水平顯著低于對照組，亞細(xì)亞酸中、高劑量組TNF-α水平顯著低于對照組(P<0.05)；再灌注后1 、2和4 h：亞細(xì)亞酸低、中和高劑量組IL-1β和TNF-α水平顯著低于對照組(P<0.05)。

圖1 MyD88和NF-κB電泳條帶

Fig 1 Electrophoresis strip of MyD8 and NF-κB in different groups

Notes 1: Sham group; 2 I/R group; 3 asiatic acid low dose group; 4 asiatic acid medium dose group; 5 asiatic acid high dose group

表1 各組MDA，ROS-HR、SOD、GSH-PX、MyD88和NF-κB水平比較

Notes 1)vssham group,P<0.05; 2)vsI/R group,P<0.05

2.6 各組再灌注2 h血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)庵笜?biāo)比較 表2顯示，各組在體溫、肺局部溫度、Hb水平和血液pH值指標(biāo)上差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。缺血再灌注2 h時(shí)點(diǎn)對照組與假手術(shù)組比較，血液動(dòng)力學(xué)指標(biāo)心率顯著減慢、動(dòng)脈收縮壓、動(dòng)脈舒張壓和平均壓顯著下降(P均<0.05)；外周血WBC顯著增高(P<0.05)；血?dú)庵笜?biāo)PO2顯著下降，PCO2顯著升高(P<0.05)。

圖2 各組灌注前和灌注后不同時(shí)點(diǎn)TNF-α和IL-1β水平比較

Fig 2 Comparison of TNF-α IL-1βlevels before and after reperfusion at different time points in different groups

Notes Before reperfusion, the TNF-α IL-1βlevels of I/R group were siginificant higher than sham group(P<0.05). 1, 2 and 4 h after reperfusion, TNF-α and IL-1βlevel of asiatic acid low, middle and high dose group were siginificant lower than sham group(P<0.05)

亞細(xì)亞酸低、中、高劑量組與對照組相比，血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)心率顯著加快、動(dòng)脈收縮壓、動(dòng)脈舒張壓和平均壓顯著上升(P<0.05)；外周血WBC計(jì)數(shù)顯著降低(P<0.05)；血?dú)庵笜?biāo)PO2顯著升高，PCO2顯著下降(P<0.05)，上述指標(biāo)不同劑量亞細(xì)亞酸組間無顯著差異(P>0.05)，與假手術(shù)組差異也無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 各組肺組織病理學(xué)改變 假手術(shù)組光鏡下可見肺泡清晰，結(jié)構(gòu)完整，無塌陷，無腫脹或滲液(圖3A)；對照組可見肺組織微血栓阻塞毛細(xì)血管，較多白細(xì)胞侵潤，肺泡細(xì)胞與間隔組織腫脹明顯，肺泡腔內(nèi)有較多滲液，部分肺泡腔塌陷(圖3B)；亞細(xì)亞酸低劑量組肺組織損傷較對照組略有改善，可見白細(xì)胞侵潤，肺泡和間隔組織腫脹明顯，肺泡腔內(nèi)較多滲液，間質(zhì)炎細(xì)胞多見(圖3C)；亞細(xì)亞酸中、高劑量組肺組織損傷明顯好轉(zhuǎn)，可見肺泡細(xì)胞與間隔組織輕微腫脹，肺泡腔內(nèi)滲液消失，少見微血栓阻塞毛細(xì)血管，無明顯白細(xì)胞侵潤，少部分肺泡腔略塌陷(圖3D,E)。

假手術(shù)組電鏡下可見肺泡壁結(jié)構(gòu)完整，上皮細(xì)胞及其游離面有少量的微絨毛清晰，基底膜完整，細(xì)胞核較大，居中，線粒體圓或橢圓，核糖體豐富，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短桿狀，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有大量的板層小體(圖4A)；對照組可見上皮細(xì)胞腫脹，線粒體腫脹電子密度降低、局灶性空化變性，嵴消失、破裂，基底膜菲薄，吞飲小泡增多，表面微絨毛形成指狀突起，基底膜水腫、增厚(圖4B)；亞細(xì)亞酸低劑量組肺組織電鏡結(jié)構(gòu)較對照組略有改善，細(xì)胞結(jié)構(gòu)模糊、排列尚規(guī)整，吞飲小泡存在，仍有空化變性，基底膜水腫、增厚(圖4C)；亞細(xì)亞酸中、高劑量組可見肺泡結(jié)構(gòu)存在，細(xì)胞器略減少，但結(jié)構(gòu)相對正常，線粒體無明顯腫脹，無明顯空化變性，無空化變性，嵴存在，間質(zhì)血管略充血，可見間質(zhì)炎細(xì)胞，間質(zhì)纖維結(jié)構(gòu)上清晰、排列尚規(guī)整(圖4D,E)。

表2 各組再灌注2 h時(shí)點(diǎn)血液動(dòng)力學(xué)和血?dú)庵笜?biāo)比較

Notes 1)vssham group,P<0.05; 2)vsI/R group,P<0.05

圖3 各組肺組織光鏡下所見(HE staining, ×100)

Fig 3 Findings under light microscope of lung tissue in 5 groups(HE staining, ×100)

Notes A: sham group showed the normal lung structure; B: I/R group showed remarkable alveolar and interstitial edema, alveolar space collapse, infiltrated inflammatory cells, and detached epithelial cells; C: asiatic acid low dose group showed slightly decreased alveolar and interstitial edema; D,E: asiatic acid middle and high dose group showed obviously decreased alveolar and interstitial edema, alveolar space collapse and detached epithelial cells

圖4 各組肺組織電鏡下所見(×10 000)

Fig 4 Findings under transmission electron microscope of lung tissue in 5 groups(×10 000)

Notes A: sham group showed the normal lung structure; B: I/R group showed swollen, vacuolated and near-broken mitochondria; C: asiatic acid low dose group showed slightly improvement of mitochondria; D,E: nearly normal appearance of mitochondria

3 討論

目前認(rèn)為肺缺血再灌注損傷和全身炎癥反應(yīng)是體外循環(huán)相關(guān)性肺損傷最主要的發(fā)生機(jī)制[8]。在肺動(dòng)脈恢復(fù)灌注后，大量氧和血進(jìn)入肺臟，產(chǎn)生大量氧自由基、炎癥因子和細(xì)胞酶類，導(dǎo)致肺血管內(nèi)皮細(xì)胞廣泛受損，通透性增加，導(dǎo)致肺缺血/再灌注損傷。晚近有研究報(bào)道，嬰幼兒器官組織抗氧化能力較低，更易受到氧化應(yīng)激的侵害[7,9～11]。本研究前期證實(shí)了未成熟兔肺更容易發(fā)生缺血再灌注損傷，且損傷程度和時(shí)間均較成熟兔更為嚴(yán)重[11]。

ROS和MDA是反映組織的損傷指標(biāo)，MDA體現(xiàn)機(jī)體細(xì)胞氧化損傷的程度。缺血再灌注可導(dǎo)致SOD水平和活性下降，ROS過度釋放，MDA水平增高，血循環(huán)TNF-α、IL-1β水平升高[13]，線粒體功能下降，組織細(xì)胞死亡。本研究顯示15～21日齡兔建立的缺血再灌注模型可觀察到上述指標(biāo)的變化，提示建模成功。

亞細(xì)亞酸具有抗炎、抗氧化、保護(hù)線粒體及抗細(xì)胞凋亡等作用[14～16]。Gao等[17]研究顯示，亞細(xì)亞酸可清除超氧負(fù)離子和羥基，劑量依賴性抑制鈣離子誘導(dǎo)的線粒體溶脹，保護(hù)肝線粒體。Tabassum等[6]研究顯示，亞細(xì)亞酸可改善缺血再灌注后大鼠的異常行為，縮小腦梗死范圍，增高組織SOD和GSH-PX水平。Huang等[18]研究角叉菜膠誘發(fā)大鼠足趾炎性痛模型顯示，亞細(xì)亞酸可增高SOD和GSH-PX活性，降低NF-κB的表達(dá)。本研究顯示，給予亞細(xì)亞酸干預(yù)后，幼兔肺組織SOD、GSH-PX升高，ROS下降，其中以中、高劑量組效果為著；同時(shí)缺血再灌注后2、4 h時(shí)點(diǎn)血漿TNF-α和IL-1β水平顯著降低；提示一方面亞細(xì)亞酸可能通過提高肺組織的抗氧化能力和降低氧自由基的產(chǎn)生，另一方面通過降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，改善了缺血再灌注后的肺損傷。同時(shí)亞細(xì)亞酸干預(yù)組的MyD88和NF-κB表達(dá)也顯著下降，提示炎癥反應(yīng)的降低可能與其傳導(dǎo)通路上MyD88和NF-κB表達(dá)下調(diào)有關(guān)。亞細(xì)亞酸對缺血再灌注肺損傷的保護(hù)作用還體現(xiàn)在血流動(dòng)力學(xué)和血?dú)庵笜?biāo)的改善，動(dòng)物存活率的提高。

進(jìn)一步觀察各組肺組織的病理學(xué)變化，顯示與上述氧化應(yīng)激指標(biāo)變化較為一致的變化，對照組可見較為嚴(yán)重的損害，亞細(xì)亞酸低劑量組肺組織損傷略有改善，而亞細(xì)亞酸中、高劑量組可見肺組織的明顯改善。Gao等[19]觀察亞細(xì)亞酸不同劑量(25、50、100 mg·kg-1)對成熟小鼠肝損傷均有保護(hù)作用，3種劑量均可抑制線粒體鈣內(nèi)流，阻止線粒體膜電位的下降，減輕線粒體腫脹。從本研究3種干預(yù)劑量來看，低劑量組氧化應(yīng)激和炎癥指標(biāo)改善不明顯，而中和高劑量可明顯改善氧化應(yīng)激損傷，但亞細(xì)亞酸對缺血再灌注肺損傷的量效關(guān)系仍需進(jìn)一步研究。

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Asiatic acid attenuates ischemia-reperfusion induced lung injury in infant rabbits

YANXian-gang,QIUWan-shan,JIABing

(Children′sHospitalofFudanUniversity,DepartmentofCardiovascularSurgery,Shanghai201102,China)

JIA Bin, E-mail:jiabing2012@hotmail.com

ObjectiveThe aim of the study was to examine whether asiatic acid could attenuate ischemia-reperfusion(I/R) induced lung injury in infant rabbits.Methods60 New Zealand white rabbits aged from 15 to 21 days were subjected to sham operation, I/R, low dose asiatic acid plus I/R, medium dose asiatic acid puls IR, and high dose asiatic acid puls I/R. I/R was induced by clamping the right pulmonary hilum for 1 hour and then removal of the clamp for 4 hours. Asiatic acid was given 3 days before operation by 7.5mg, 15, 30 mg·kg-1respectively. Production and expression of free radical species-hydroxyl radical (ROS-HR), malondialdehyde (MDA), superoxide dismutase (SOD), glutathione peroxidase (GSH-PX), myeloid differentiation factor-88(MyD-88), and muclear factors-κB(NF-κB) in the lung tissue were also evaluated. And temperature, hemodynamics, blood gases and neutrophil count were measured 2 hours after reperfusing. In addition, serum levels of interleukin-1β and tumor necrosis factor-α were measured during the ischemia-reperfusion process.ResultsThe infant lungs in asiatic acid middle and high dose groups had less neutrophil infiltration, edema, swelled alveolar epithelial and endothelial cells under light and electron microscopes. ②Compared wtih I/R group, asiatic acid reduced the production of ROS-HR and MDA and improved the activities of GSH-PX and SOD markedly, siginificantly decreased the serum levels of interleukin- 1β and tumor necrosis factor-α at 4 h time point after reperfusion, as well as the MyD88 and NF-κB of lung were siginificantly decreased(P<0.05).③Asiatic acid middle and high dose groups had good effect of attenuating I/R.ConclusionsAsiatic acid pretreatment reduced the lung damage induced by I/R in the infant rabbits

Infant rabbit; Ischemia-reperfusion; Lung injury; Asiatic acid

江蘇省自然科學(xué)基金：BK2009452

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院心血管中心 上海，201102

賈兵，E-mail:jiabing2012@hotmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.014

2013-03-12

2013-04-01)

丁俊杰)