呂俊蘭 劉 京 張禮萍 李久偉 孫 欣 郎志奇 丁昌紅 陳春紅

·論著·

兒童早發(fā)型腓骨肌萎縮癥2型21例線粒體融合蛋白2基因型和表型分析

呂俊蘭1劉 京2張禮萍3李久偉1孫 欣1郎志奇4丁昌紅1陳春紅1

目的 分析兒童腓骨肌萎縮癥2型(CMT2)線粒體融合蛋白2(MFN2 )基因型與臨床表型。方法 納入1998至2012年首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院臨床診斷的CMT2患兒為研究對象，采用直接測序方法檢測MFN2 突變基因，并描述分析突變和未突變患兒的臨床表型、神經(jīng)電生理、實驗室和病理學檢查特征。結果 21例CMT2患兒進入分析。①未檢出MFN2 基因突變18例(男14例，女4例)，起病年齡平均3.3歲。其中9例累及下肢近端和遠端，7例累及四肢，2例無法行走，8例下肢近端和遠端肌肉萎縮，4例可見輕微感覺障礙。MFN2 基因突變3例(男2例，女1例)，起病年齡1.5～8歲，1例有家族史。均可見下肢近端和遠端肌肉萎縮，2例足下垂并內翻，均有感覺障礙表現(xiàn)。②21例運動和(或)感覺神經(jīng)傳導速度≥38 m·s-1或波幅降低，MFN2 基因突變患兒腓總神經(jīng)和脛神經(jīng)復合肌肉動作電位波幅較正常值的下降幅度高于未突變患兒；③10例行腓腸神經(jīng)活檢檢查，其中MFN2 基因突變1例，未檢出MFN2 突變9例，均符合慢性軸索神經(jīng)病病理改變, 電鏡下可見軸索線粒體聚集排列和腫脹。結論MFN2 基因突變是CMT2的致病原因之一，攜帶該突變患兒多為早發(fā)型，臨床表型可能重于未突變者，仍需擴大樣本量進一步分析。

腓骨肌萎縮癥2型； 線粒體融合蛋白2基因； 臨床表型； 兒童

腓骨肌萎縮癥(CMT) 是遺傳性感覺運動神經(jīng)病(HMSN)的一個最重要的亞型，臨床表現(xiàn)為慢性進行性的多發(fā)性周圍神經(jīng)病。CMT依據(jù)病理和神經(jīng)電生理改變可以分為2個主要亞型，脫髓鞘型(CMT1)，神經(jīng)傳導速度<38 m·s-1；軸索型(CMT2)，神經(jīng)傳導速度≥38 m·s-1。CMT遺傳方式多樣，可表現(xiàn)為常染色體顯性、隱性或X性聯(lián)遺傳[1，2]。 線粒體融合蛋白2(MFN2 )基因突變可導致線粒體GTP酶的動力學障礙，是常染色體顯性遺傳CMT2患者的致病原因之一。國內關于CMT2患兒的報道較少，且鮮見關于其基因型和臨床表型的分析。本研究前期已對CMT患兒的電生理與病理特征進行了研究[3,4]，之后診斷病例逐漸增多，本文主要報道CMT2型患兒MFN2 基因突變與臨床表型相關性，以期加強對該病的認識。

1 方法

1.1 納入標準 ①首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院臨床診斷CMT2的連續(xù)病例，符合Dyck周圍神經(jīng)病學的相關診斷標準[1]：a.以進行性對稱性肌無力和萎縮為主要臨床特征。足和腿首先受累，之后累及手和前臂。踝關節(jié)背屈、跖屈力量減弱，背屈減弱更為明顯，伴上肢遠端不同程度的肌無力?？捎泄巫慊蝈N狀趾和局限性的感覺障礙, 但在體表不能觸及粗大的神經(jīng)；b.神經(jīng)傳導檢查：上肢運動神經(jīng)傳導速度(MCV)正常(≥38 m·s-1)，可有下肢MCV輕微減慢，以復合肌動作電位降低為主要特征。針刺肌電圖檢查表現(xiàn)為遠端肌肉運動單位電位時限增寬、波幅增高，募集減少，伴有失神經(jīng)表現(xiàn)；②進行MFN2 基因突變篩查者。

1.2 對照組 選取非神經(jīng)系統(tǒng)疾病的正常兒童作為MFN2 基因檢測對照，樣本量與CMT2患兒1∶1匹配。

1.3MFN2 基因突變檢測方法 采集靜脈血提取外周血白細胞DNA。MFN2 基因的編碼外顯子3～19號的引物序列通過軟件Primer 5.0 設計, 由上海生物工程技術服務有限公司合成; 使用ABI3730XL測序儀(美國), 采用直接測序的方法對MFN2 基因的17個外顯子進行測序，應用DNA star，Chromas軟件和http://blast.ncbi.nlm.nih.gov分析測序結果對比，經(jīng)鑒定出的突變行反向測序驗證。

1.4 神經(jīng)電生理檢查方法 采用KEYPOINT肌電圖誘發(fā)電位儀, 檢測方法及判別方法參見文獻[1]。檢測神經(jīng)包括正中神經(jīng)、尺神經(jīng)、腓總神經(jīng)、脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)?！?歲神經(jīng)傳導速度和復合肌肉動作電位(CMAP)波幅的正常范圍以健康成人正常值作為參照；<3歲為成人正常值的80%，遠端潛伏期為成人正常值的120%。

1.5 腓腸神經(jīng)活檢病理檢查 取外踝和跟腱正中切口，切取腓腸神經(jīng)約2 cm，分成2段。一段中性福爾馬林固定，石蠟包埋，取標本橫向、縱向切片，行蘇木精-伊紅和剛果紅(LHE)染色，光鏡觀察。另一段以樹脂包埋,半薄切片,甲苯胺藍染色,光鏡觀察。選擇病變明顯部位進行定位修塊,超薄切片,電鏡觀察。由專業(yè)技術員按標準化方法完成。

1.6 分組和資料截取 依據(jù)MFN2 基因檢測結果分為突變組和未突變組。并從病史中截取以下信息進行兩組的描述性分析：①一般情況：性別、起病年齡、就診年齡和病程；②臨床表現(xiàn)：肌無力、萎縮，足和手畸形，感覺障礙等；③神經(jīng)電生理檢查：MCV和感覺神經(jīng)傳導速度(SCV)；④影像學檢查：頭顱CT或MRI；⑤實驗室檢查：肌酶、CSF生化；⑥肌肉病理學檢查等。

2 結果

2.1 一般情況 1998至2012 年符合CMT2臨床診斷21例患兒進入分析，男16例，女5例。對照組納入21例，平均年齡3.5歲。

2.2MFN2基因突變檢測結果 21例CMT2患兒行MFN2 基因檢測，發(fā)現(xiàn)3種突變位點，均為雜合錯義突變。例5第12號外顯子出現(xiàn)c. 1 253 G→A改變，導致MFN2蛋白第418位精氨酸被谷氨酰胺替換(R418Q)(圖1A)。例8 測序結果第19號外顯子出現(xiàn)c. 2 213 C→T改變，導致MFN2蛋白第738位丙氨酸被纈氨酸替換(A738V)(圖1B)。例12測序結果第11號外顯子出現(xiàn)c. 1 040 C→T，導致MFN2蛋白第364位精氨酸被色氨酸替換(R364W)(圖1C)。查閱突變數(shù)據(jù)庫和多態(tài)數(shù)據(jù)庫，位于第11號外顯子c.1 040 C→T，第12號外顯子c. 1 253 G→A為已報道的致病熱點突變；第19號外顯子的c. 2 213 C→T為首次報道的雜合錯義突變。21例正常對照組均沒有發(fā)現(xiàn)上述3種基因突變。

圖1 本文3例患兒MFN2基因突變患兒外顯子測序圖

Fig 1 Mutations ofMFN2 gene in three CMT2 patients

Notes A: case 5, exon-12, c. 1253 G→A(R418Q); B: case 8, exon-9,c. 2213 C→T(A738V);C: case 12, exon-9, c. 1040 C→T(R364W)

2.3 臨床表現(xiàn) 如表1所示，3例MFN2 基因突變患兒，男2例，女1例。起病年齡1.5～8歲。1例為常染色體顯性遺傳。3例均可見四肢肌肉無力和以下肢近端和遠端肌肉為主的萎縮，2例足下垂并內翻。2例輕微感覺障礙，1例明顯感覺障礙。

18例未檢出MFN2基因突變患兒，男14例，女4例。起病年齡平均3.3歲，就診年齡平均7.6歲，病程平均2.8歲。2例有家族史。18例均有肌肉無力表現(xiàn)，其中9例累及下肢近端和遠端，7例累及四肢，2例無法行走；18例均可見肌肉萎縮，其中8例累及下肢近端和遠端，10例累及四肢。單純足下垂8例，足下垂并內翻9例，四肢畸形1例。4例可見輕微感覺障礙。

2.4 神經(jīng)電生理檢查 表2顯示，除例17未行神經(jīng)電生理檢測外，20例正中神經(jīng)MCV均>38 m·s-1, 均有運動和(或)感覺神經(jīng)傳導速度波幅降低(或未引出電位)。MFN2基因突變患兒腓總神經(jīng)CMAP波幅平均為0.007 mV，較正常值下降97%；脛神經(jīng)CMAP波幅平均為0.57 mV，較正常值下降72%；MFN2基因無突變患兒：腓總神經(jīng)CMAP波幅平均為1.80 mV， 較正常值下降10%；脛神經(jīng)CMAP波幅平均為1.60 mV，較正常值下降20%。非突變組， 腓總神經(jīng)CMAP波幅均值為1.8， 較正常均值下降10%， 脛神經(jīng)CMAP波幅均值1.6， 較正常均值下降20%。

2.5 影像學檢查 5/21例行頭顱CT或MRI檢查，其中MFN2基因突變和未突變分別為2例和3例，1例發(fā)現(xiàn)有鞍上池囊腫(MFN2基因未突變，例4), 余4例正常。

2.6 實驗室檢查 4/21例(MFN2基因未突變3例，突變1例)血生化檢查提示有肌酸激酶的輕度升高；MFN2基因突變1例(例5)CSF蛋白輕度升高(0.41 g·L-1)。

表2 MFN2基因突變和未突變患兒電生理檢查結果

Notes CV: conduction velocity(m·s-1);CMPA:(mV); ND: not done; NR: not run

2.7 病理學檢查 10例行腓腸神經(jīng)活檢，其中MFN2基因突變1例，未檢出MFN2J基因突變9例，均符合慢性軸索神經(jīng)病病理改變，表現(xiàn)為有髓神經(jīng)密度的減少，軸索變性的神經(jīng)纖維和再生的神經(jīng)纖維束(圖2A～C)。電鏡檢查可見軸索內聚集排列和肥大的異常線粒體(圖2D)。

圖2 腓腸神經(jīng)活檢光鏡和電鏡所見

Fig 2 Microscopic findings of sural nerve biopsy by both light and electro-microscopy

Notes A：Paraffin section，HE staining light microscope; medllated fibers were decreased, no inflammatory cell infiltration was seen.B：Frozen section，Congo red staining，no abnormal staining was observed.C ：Semi-film section， methylaniline blue staining，nerve fibers decreased obviously, especially the nerve fibers with big diameter, the nerve fibers with axonal degeneration(red arrow) and regenerative nerve fibers(blue arrow) could be observed. D ：Aggregation and edema of axonal mitochondria in meduated(blue arrow) and unmeduated(red arrow) nerve fibers were observed

3 討論

MFN2是一個大的跨膜GTP酶, 位于線粒體外膜上，定位在染色體1p36.22, 其功能為促進線粒體的融合。近年來的研究表明約1/3的CMT2患者是由MFN2基因的突變所致。MFN2基因的突變可以使神經(jīng)軸索變性和凋亡，導致周圍神經(jīng)病變。由于突變的外顯子區(qū)位于或鄰近GTP酶的功能區(qū)，故MFN2基因突變可通過影響細胞的氧化磷酸化作用，影響其能量代謝導致線粒體能量代謝異常，進而引起神經(jīng)功能的異常[5,6]。MFN2基因已發(fā)現(xiàn)多種突變類型, 其中約90%為錯義突變, 少數(shù)為終止突變, 尚未發(fā)現(xiàn)重復突變[7]。MFN2基因突變位點主要集中在GTP酶結合域(>50%)，Baloh 等[8]研究發(fā)現(xiàn)MFN2基因突變可導致神經(jīng)原軸突和感覺神經(jīng)末梢線粒體運輸傳導能力的減弱。本文3例患兒檢出的均為錯義突變，且其中1個為未報道的新突變。MFN2的基因突變率與種族相關，不同國家報道的突變率有所不同，如歐美的較大樣本(323例)CMT2 的研究表明MFN2基因突變率為8%[9]，而來自韓國的一項研究表明突變率高達33%[10]，本文CMT2患兒MFN2基因突變的檢出率為14.2%(3/21)，但因樣本量的限制，故基因突變率難有代表意義，應進一步擴大樣本量進行研究。另外, 種族的差異也是導致陽性率偏低的另一原因。本研究僅針對先證者進行了基因檢測，尚未對患兒家庭成員進行深入的研究。

CMT2可分為早發(fā)型(起病年齡<10歲)和晚發(fā)型(起病年齡≥10歲)[5,10]。本文病例發(fā)病年齡最小為6個月, 最大為13歲。3例MFN2基因突變病例中發(fā)病年齡均在10歲以內，屬于早發(fā)型CMT2病例。據(jù)國外的研究資料表明,MFN2基因突變相關的CMT2 也以早發(fā)型為多見[11，12]。CMT2多為常染色體隱性遺傳，在MFN2基因相關的神經(jīng)病變，病情的嚴重程度并不一致。從輕微受累到罹患嚴重的周圍神經(jīng)病均可存在，約25% 的MFN2基因突變者隨著病情的進展，而嚴重影響其生活質量,甚至需要輪椅。但也有病情輕者，僅有肢體遠端的輕度無力，甚至有報道MFN2基因突變的個體可以完全無癥狀[13]，提示MFN2 基因突變病例具有明顯的臨床異質性。本文MFN2基因突變病例的肌肉無力、萎縮，足和手畸形，感覺障礙的嚴重程度似乎高于無突變者；同時神經(jīng)傳導檢查顯示，MFN2基因突變病例的腓總和脛神經(jīng)的CAMP下降較無突變組更為明顯，提示軸索變性更為嚴重；但由于病例數(shù)較少，尚無法行統(tǒng)計學檢驗。

本文10例行腓腸神經(jīng)活檢，均在基因檢測前完成。均有髓神經(jīng)纖維密度的明顯減少和有髓神經(jīng)的軸索變性陽性發(fā)現(xiàn)。電鏡檢查顯示，1例MFN2 基因突變和6例無突變患兒有明顯的有髓神經(jīng)和無髓神經(jīng)纖維的線粒體結構異常，表現(xiàn)為線粒體的異常肥大和聚集排列。由于周圍神經(jīng)活檢是損傷性的檢查，建議腓腸神經(jīng)活檢應在基因檢測后進行。對于MFN2基因無突變患兒，可考慮進行腓腸神經(jīng)活檢，應用電鏡技術可清晰的觀察亞細胞結構包括線粒體是否異常[5,14 ]。

綜上，MFN2基因突變多為CMT2早發(fā)型，腓總和脛神經(jīng)的CAMP下降較無突變者更為明顯，提示軸索變性更為嚴重。

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Analysis of mitofusin 2 genotype and phenotype in 21 children with charact-marry-tooth type Ⅱ

LVJun-lan1,LIUJing2,ZHANGLi-ping3,LIJiu-wei1,SUNXin1,LANGZhi-qi4,DINGChang-hong1,CHENChun-hong1

(1DepartmentofNeurology,BeijingChildren′sHospital,theCapitalMedicineUniversity,Beijing100045; 2DepartmentofPediatrics,PekingUniversityPeople′sHospital,Beijing100044; 3DepartmentofPediatrics,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053; 4DepartmentofPathology,BeijingChildren′sHospital,theCapitalMedicineUniversity,Beijing100045,China)

LV Jun-lan, E-mail:junlanlu@gmail.com

ObjectiveTo analyzeMFN2 mutations and associated phenotypes in patients with charact-marry-tooth (CMT) type Ⅱ.MethodsChildren diagnosed as CMT 2 in Beijing Children's Hospital from 1998 to 2012 were included.Direct sequencing of theMFN2 gene and clinical investigations were performed in patients withMFN2 mutations. The clinical features, electrophysiological finding, labortory test and pathology of paitients with and withoutMFN2 mutations were analyzed. ResultsTwenty one cases with CMT 2 were included in the study.①No gene mutation was detected in 18 cases (male 14 cases, female 4 cases). The average age of the onset of the disease was 3.3 years. Nine of them involved in both proximal end and distal end of lower limb, seven cases involved in limbs, two cases could not walk, eight cases were with myophagism of proximal and distal ends of lower limb, mild sensory disturbance could be detected in four cases. Three different missense mutations were identified in 3 patients (male 2 cases, female 1 case). The age of onset ranged from 1.5 to 8 years, one had a family history of autosomal dominant inheritance. Myophagism of proximal and distal ends of lower limb could be found in all cases, foot drop with strephenopodia were observed in two cases, and all with sensory disturbance. ②Conduction velocity great than 38 m·s-1of motor nerve and/or sensory nerve, or decreased amplitude could be detected in all cases. The decreased value of CAMP of common peroneal nerve and tibial nerve was higher inMFN2 gene mutation children than that in children withoutMFN2 mutation.③Sural nerve examination was performed in ten cases, one of them withMFN2 gene mutation, nine withoutMFN2 gene mutation, prominent mitochondrial abnormalities in both myelinated and unmyelinated nerve fibers were observed under electronic microscope.ConclusionsMFN2 mutations was one of the causes of CMT2 with either dominant or recessive inheritance. The age of onset of patients withMFN2 gene mutation usually was before 10 years old.

Charact-marry-tooth type Ⅱ;MFN2 gene； Phenotype; Children

北京市教育委員會科技計劃面上項目：KM200910025021

1 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院神經(jīng)內科與康復中心 北京，100045；2 北京大學人民醫(yī)院兒科 北京，100044；3 首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院兒科 北京，100053；4 首都醫(yī)科大學附屬北京兒童醫(yī)院病理科電鏡室 北京，100045

呂俊蘭，E-mail:junlanlu@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-5501.2013.02.010

2012-10-27

2013-01-13)

丁俊杰)