田智斌，董超，史延茂，張聰莎，李君華

1(河北工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院 生物工程系，天津，300100)

2(河北省生物研究所細(xì)胞與生化研究室，河北石家莊，050081)

納豆激酶(nattokinase，NK)是納豆芽孢桿菌(Bacillus natto)在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，是一種具有纖維蛋白溶解活性的堿性絲氨酸蛋白酶［1］。相比鏈激酶、尿激酶等已廣泛用于臨床的溶栓制劑，NK具有安全高效、出血傾向小、體內(nèi)半衰期長(zhǎng)、可口服、成本低廉等特點(diǎn)，有望開發(fā)成為一種新型的溶栓藥物或保健食品［2-3］。固態(tài)發(fā)酵的納豆通過真空冷凍干燥工藝制成納豆凍干粉，可直接作為一種食源性溶栓制品，無需下游分離提取等繁雜工序。在同等生產(chǎn)成本的情況下采用固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)NK比液態(tài)發(fā)酵具有更高的產(chǎn)率［4］。

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選影響產(chǎn)NK的主效應(yīng)參數(shù)和最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最佳產(chǎn)酶響應(yīng)區(qū)域，采用響應(yīng)面設(shè)計(jì)和人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法［5］優(yōu)化了NK固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)，同時(shí)比較了這兩種方法的優(yōu)化效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與試劑

納豆芽孢桿菌，河北省科學(xué)院生物研究所保存菌株;牛纖維蛋白原，Sigma;凝血酶(1 000U/支)，Solarbio;注射用尿激酶(10 000U/支)，北京賽生藥業(yè)有限公司;瓊脂糖，北京奧博星生物技術(shù)有限公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(%):蛋白胨1，牛肉浸膏0.5，NaCl 0.5，瓊脂 1.2，pH 7.2 ～7.5。

種子培養(yǎng)基(%):蛋白胨1，牛肉浸膏0.5，NaCl 0.5，pH 7.2 ～7.5。

固態(tài)發(fā)酵原始培養(yǎng)基(%):大豆裝量90 g/250 mL，蔗糖 1.5，MgSO4·7H2O 0.1，CaCl20.2，自然 pH。

1.1.3 主要儀器

PW/10-002型臺(tái)式保溫培養(yǎng)箱，重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;VS-1300U型超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司;SKY-2012C恒溫?fù)u床，常州諾基儀器有限公司;WJ-2型恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化

將4℃保存的納豆芽孢桿菌菌株轉(zhuǎn)接至試管斜面培養(yǎng)基，33℃恒溫培養(yǎng)24 h備用。

1.2.2 種子液培養(yǎng)

挑取斜面種子1環(huán)轉(zhuǎn)接入裝有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，33℃、200 r/min，搖床恒溫培養(yǎng)14～15 h，取樣鏡檢，無其他雜菌污染即可用于固態(tài)發(fā)酵。

1.2.3 三角瓶固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案配制不同組分比例的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝入250 mL三角瓶中，封口，滅菌。在無菌操作條件下，按試驗(yàn)方案向各三角瓶中接入不同比例的納豆菌種子液，封口并搖勻，置于已消毒的恒溫恒濕培養(yǎng)箱進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)，不同時(shí)間段取樣并測(cè)定NK酶活。

1.2.4 NK酶活的測(cè)定及定義

采用改進(jìn)的瓊脂糖-纖維蛋白平板法測(cè)定［6］。

NK酶活單位定義為［8］:在 37℃，1 min 內(nèi)分解1 nmol溶解于0.1 mol/L(pH7.4)H3PO4緩沖液中的H-D-Val-Leu-Lys-pNA(濃度為5×10-4mol/L)的NK量為1U。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)［7-9］篩選影響產(chǎn)NK的主效應(yīng)參數(shù)

通過單因素預(yù)試驗(yàn)確定了影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)NK的參數(shù)有接種量、基質(zhì)初始含水量、大豆裝量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、蔗糖、MgSO4·7H2O和 CaCl2的添加量。選用試驗(yàn)次數(shù)N=12的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，參考經(jīng)驗(yàn)對(duì)這8個(gè)參數(shù)進(jìn)行考察，分別記為 A，B，D，E，G，H，K，L，每個(gè)參數(shù)分別取2個(gè)水平，低水平為單因素試驗(yàn)最佳培養(yǎng)條件，記為“-1”;高水平按照因素的特點(diǎn)和經(jīng)驗(yàn)取值，記為“1”。另外均勻設(shè)置3個(gè)虛擬項(xiàng)C，F(xiàn)，J，用于對(duì)試驗(yàn)誤差進(jìn)行估計(jì)。在Design Expert 8.0界面操作環(huán)境下，得到的各參數(shù)水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)各參數(shù)水平Table 1 Parameters and level values of Plackett-Burman test

1.3.2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)

為建立有效的數(shù)學(xué)模型，應(yīng)先逼近固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)NK的最大產(chǎn)酶區(qū)域。根據(jù)Plackett-Burman法篩選出的顯著因素效應(yīng)值大小比例設(shè)定步長(zhǎng)，以試驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榕榔路较?，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳響應(yīng)區(qū)域［10］。最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表2。

表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The steepest ascent experiment design

1.3.3 響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)［11］

為了確定NK固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)的最優(yōu)水平，本次試驗(yàn)選用響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，主效應(yīng)參數(shù)和各參數(shù)水平如表3所示。

表3 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)水平編碼表Table 3 Parameters and levels of central composite design

1.3.4 人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)耦合遺傳算法全局尋優(yōu)

為得到最佳工藝參數(shù)方案，需首先建立ANN模型。試驗(yàn)采用單隱層的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(back propagation neural network)［12］，包括輸入層、隱含層和輸出層，試驗(yàn)設(shè)計(jì)輸入層的神經(jīng)元數(shù)目為3個(gè)，分別代表表2中的發(fā)酵溫度、MgSO4·7H2O的添加量和CaCl2的添加量，NK酶活作為輸出層單元。

ANN建模完成后，通過Matlab7.1及其附帶的GAOT工具箱編寫遺傳算法程序，并利用遺傳算法對(duì)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型進(jìn)行全局尋優(yōu)。試驗(yàn)采用浮點(diǎn)編碼的方式對(duì)輸入層神經(jīng)元進(jìn)行編碼并在各自取值范圍內(nèi)進(jìn)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模擬推算，以預(yù)測(cè)NK酶活作為GA的適應(yīng)度函數(shù)，對(duì)影響產(chǎn)NK的固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)進(jìn)行全局尋優(yōu)。

1.3.5 RSM優(yōu)化納豆激酶固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)和ANN-GA的比較

為了評(píng)價(jià)模型的擬合能力和預(yù)測(cè)能力，分別計(jì)算所建立2種模型的均方根誤差(RMSE)、相關(guān)系數(shù)(R2)和預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤差(SEP)［13］:

其中:Yi，e表示期望輸出值;Yi，p表示預(yù)測(cè)輸出值;表示期望輸出值的算術(shù)平均值;n為數(shù)據(jù)的組數(shù)。

同時(shí)，對(duì)兩種方法優(yōu)化后的最佳方案進(jìn)行驗(yàn)證，并分別計(jì)算預(yù)測(cè)值和實(shí)際值的相對(duì)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果及分析

Plackett-Burman具體試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 N=12的Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 4 Plackett-Burman design and responding values(N=12)

各試驗(yàn)因素的顯著性分析如表5所示。試驗(yàn)因素和響應(yīng)值擬合的模型顯著，僅有3.53%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)不能用該模型解釋，而預(yù)測(cè)RPred2值為65.99%也能合理地說明校正決定系數(shù)RAdj2=80.44%值的變化，變異系數(shù)3.80%較小，信噪比為有效信號(hào)與噪聲的比值，大于4即可視為合理，即該模型能較好地反映各因子的變化情況。最終篩選出的主效應(yīng)參數(shù)為發(fā)酵溫度(E)和培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O(K)、CaCl2(L)的添加量。

表5 Plackett-Burman試驗(yàn)因素方差分析表Table 5 ANOVA of Plackett－Burman design factors

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)參數(shù)水平的中心點(diǎn)

選擇E、K和L這3個(gè)主效應(yīng)參數(shù)進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，其他對(duì)產(chǎn)酶無顯著影響的參數(shù)在下一步優(yōu)化中可不予考慮。由最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果(圖1)可知，隨著MgSO4·7H2O、CaCl2添加量的增加和發(fā)酵溫度的降低，NK酶活大小呈先升后降的趨勢(shì)，且不同處理間存在顯著性差異(P＜0.05)，因此選擇處理3為后續(xù)試驗(yàn)的中心點(diǎn)進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖1 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果Fig.1 Corresponding results of steepest ascent design

2.3 響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果與響應(yīng)面分析

2.3.1 中心組合設(shè)計(jì)結(jié)果與回歸模型方差分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)確定的主效應(yīng)參數(shù)，最陡爬坡試驗(yàn)得到的響應(yīng)面設(shè)計(jì)中心點(diǎn)，設(shè)計(jì)3因素5水平共20個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的中心組合試驗(yàn)，其中14個(gè)為析因點(diǎn)試驗(yàn)，6個(gè)零點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表6。

表6 CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Central composite design and corresponding results

以NK酶活為響應(yīng)值，使用Design Expert 8.0軟件對(duì)表6的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，見表7。最小二乘法擬合二次多項(xiàng)式方程，試驗(yàn)因子與響應(yīng)值的關(guān)系可用以下方程表示:

由表7可知，所選模型的不同處理間差異極顯著(P＜0.0001)，說明采用該回歸方程描述各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系時(shí)，其響應(yīng)變量與自變量之間的二次線性關(guān)系顯著，即該試驗(yàn)方法可靠;決定系數(shù)R2=93.59%表明相關(guān)性較顯著;失擬項(xiàng)差異不顯著，表明該多項(xiàng)式對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合情況較好，試驗(yàn)誤差較小;值為70.26%也能較合理地說明校正決定系數(shù)=87.83%的變化，僅4.71%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)不能用此模型來解釋，信噪比大于4。因此，可以用該方程代替各組試驗(yàn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表7 CCD試驗(yàn)因子方差分析表Table 7 ANOVA for central composite design factors

2.3.2 NK產(chǎn)量的響應(yīng)面分析

圖2～圖4是根據(jù)上述多元回歸方程繪制出的響應(yīng)曲面圖及其等值線圖，當(dāng)發(fā)酵溫度、MgSO4·7H2O、CaCl2三個(gè)變量中的某一個(gè)因素固定于中心水平時(shí)，其他兩個(gè)因素共同作用對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響呈拋物面型關(guān)系，變化趨勢(shì)都是先增大后減小，且響應(yīng)面均存在一個(gè)極大值點(diǎn)，各因子變化范圍均在零點(diǎn)附近。等值線呈圓形說明兩因子之間交互作用不顯著，呈橢圓形則表明作用顯著。不難看出，圖4中等值線較圖2、圖3等值線更加“扁”，表明MgSO4·7H2O添加量和CaCl2添加量的交互效應(yīng)對(duì)產(chǎn)NK影響較顯著，其結(jié)果和表7中描述的一致。

圖2 發(fā)酵溫度與MgSO4·7H2O添加量交互影響的響應(yīng)面圖和等值線圖(L=0)Fig.2 Response surface and contour plots describing the interactive effects of fermentation temperature and MgSO4·7H2O concentration(L=0)

圖3 發(fā)酵溫度與CaCl2添加量交互影響的響應(yīng)面圖和等值線圖(K=0)Fig.3 Response surface and contour plots decribing the interactive effects of fermentation temperature and CaCl2concentration(K=0)

圖4 MgSO4·7H2O添加量與CaCl2添加量交互影響的響應(yīng)面圖和等值線圖(E=0)Fig.4 Response surface and contour plots describing the interactive effects of MgSO4·7H2O concentration and CaCl2concentration(E=0)

2.4 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

經(jīng)過多次嘗試和比較，BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)隱含層神經(jīng)元數(shù)目最終確定為6個(gè)，構(gòu)建拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)為3-6-1的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，如圖5所示。為了使ANN-GA和RSM的優(yōu)化結(jié)果具有可比性，構(gòu)建BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)均基于表3中的參數(shù)水平范圍，并將表6中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)作為學(xué)習(xí)樣本進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練，設(shè)置性能函數(shù)為“MSE”，當(dāng)網(wǎng)絡(luò)的目標(biāo)誤差達(dá)到10-3時(shí)結(jié)束訓(xùn)練。分別調(diào)用隱含層傳遞函數(shù)“tansing”，輸出層傳遞函數(shù)“purelin”，訓(xùn)練函數(shù)“traingdm”。從圖6可知，ANN預(yù)測(cè)輸出值和試驗(yàn)測(cè)定值總體上很“接近”，表明建立的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)性能良好，在已知3個(gè)輸入?yún)?shù)值時(shí)，可以用于預(yù)測(cè)NK酶活大小。

圖5 單隱層BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)示意圖Fig.5 Topological structure diagram of single hidden layer back propagation neural network

2.5 采用遺傳算法對(duì)BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)全局尋優(yōu)

以BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的輸出值為遺傳算法的適應(yīng)度函數(shù)，GA初始種群數(shù)為10，進(jìn)化次數(shù)為100次，交叉概率0.4，變異概率0.2，經(jīng)過73代的迭代過程，適應(yīng)度趨于穩(wěn)定，從圖7中可以看出，群體的適應(yīng)度函數(shù)變化趨勢(shì)達(dá)到最大值，即NK酶活最大值為7 742.05 U/g，其對(duì)應(yīng)的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:發(fā)酵溫度36.09℃，MgSO4·7H2O和 CaCl2的添加量分別為0.21%、0.27%，其他參數(shù)值維持在初始水平。

圖6 RSM、ANN模型預(yù)測(cè)輸出值和試驗(yàn)測(cè)定值的比較Fig.6 Topological structure diagram of single hidden layer back propagation neural network

圖7 遺傳算法中適應(yīng)度函數(shù)值每代的變化曲線Fig.7 Topological structure diagram of single hidden layer back propagation neural network

2.6 RSM和ANN-GA對(duì)NK固態(tài)發(fā)酵工藝參數(shù)優(yōu)化的對(duì)比

由表6中兩種模型的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，ANN擬合模型的R2高于RSM擬合的模型，RMSE低于RSM擬合模型，較高的相關(guān)系數(shù)和較低的均方差都表明ANN模型對(duì)表6中試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合效果更佳;ANN模型的SEP相對(duì)RSM模型較低，則表明ANN擬合模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有較好的預(yù)測(cè)效果和試驗(yàn)數(shù)據(jù)泛化能力。

分別以RSM和ANN-GA得到的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)值進(jìn)行5次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果與2種優(yōu)化方法預(yù)測(cè)結(jié)果的比較見表8。結(jié)果顯示響應(yīng)面法較人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)合遺傳算法優(yōu)化后的NK酶活低，表明響應(yīng)面法預(yù)測(cè)的極值并不是真實(shí)的NK最大酶活，并且預(yù)測(cè)NK酶活與實(shí)際NK酶活的相對(duì)誤差較ANN-GA高，這也進(jìn)一步印證了ANN-GA優(yōu)化方法所得的模型具有更好的預(yù)測(cè)能力。通過前期單因素試驗(yàn)得到的最大NK酶活為5 914.92±328.61 U/g，采用RSM和ANN-GA 2種方法優(yōu)化后的NK酶活分別提高了13.72%和29.02%。

表8 RSM和ANN-GA試驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證和比較Table 8 Verification and comparison of corresponding results by RSM and ANN-GA

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)確定了影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)NK的固態(tài)發(fā)酵參數(shù)有接種量、基質(zhì)初始含水量、大豆裝量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、蔗糖、MgSO4·7H2O和CaCl2的添加量。采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)從這8個(gè)影響因子中篩選出影響產(chǎn)NK的主效應(yīng)參數(shù)為發(fā)酵溫度、MgSO4·7H2O和CaCl2的添加量，之后通過最陡爬坡路徑逼近響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)，采用中心組合設(shè)計(jì)方法，以發(fā)酵溫度、MgSO4·7H2O和CaCl2的添加量這3個(gè)參數(shù)為自變量，NK酶活為響應(yīng)值，建立產(chǎn)酶回歸模型，確定了模型最佳取值時(shí)的各參數(shù)水平值:接種量4%，初始含水量55%，大豆裝量90 g/250 mL，發(fā)酵溫度36.09℃，蔗糖添加量1.5%，MgSO4·7H2O添加量0.21%，CaCl2添加量0.27%，發(fā)酵時(shí)間24 h。其中發(fā)酵培養(yǎng)基中MgSO4·7H2O的添加量和CaCl2添加量的交互作用對(duì)NK酶活影響最為顯著。

NK固態(tài)發(fā)酵過程是一個(gè)高度復(fù)雜的非線性系統(tǒng)，響應(yīng)面法擬合限制在多元二次多項(xiàng)式的基礎(chǔ)上，復(fù)相關(guān)系數(shù)為93.59%，因此其對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合能力有限;人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)則采用全局性的非線性擬合，無需預(yù)先給出具體函數(shù)表達(dá)式，相關(guān)系數(shù)為99.66%，較響應(yīng)面法有更好的擬合度，并且模型具有較強(qiáng)的外推能力。在尋優(yōu)方面，雖然RSM能反映固態(tài)發(fā)酵參數(shù)對(duì)NK產(chǎn)量所起作用的大小，但是所預(yù)測(cè)的值并不是工藝的最佳條件，而基于ANN的遺傳算法得到的結(jié)果則具有更好的極值預(yù)測(cè)能力。同時(shí)采用ANN-GA方法可以有效的減少試驗(yàn)次數(shù)和降低研究成本，這也為其他復(fù)雜的非線性發(fā)酵過程優(yōu)化提供了方法借鑒。

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