范修海，苑曉慧，陳啟佳，滿麗莉，2，李雪，牛墨，3，孟祥晨

1(東北農業(yè)大學乳品科學教育部重點實驗室，黑龍江哈爾濱，150030)2(黑龍江農業(yè)經濟職業(yè)學院，黑龍江 牡 丹江，157041)3(牡丹江出入境檢疫檢驗局，黑龍江牡丹江，157041)

細菌素是由某些細菌通過核糖體合成機制產生的一種抗菌肽或蛋白質，可抑制或殺滅與其產生菌同屬(窄譜)或不同屬(廣譜)的其他細菌［1-2］。乳酸菌代謝產生細菌素既是細菌適應性的一個重要體現(xiàn)，也是一種重要的益生特性，細菌素可與腸道其他微生物競爭，還可抑制病源微生物，因而產細菌素特性也是益生菌篩選的一項重要標準。細菌素既可以直接添加于食品中用于防腐保鮮，也可將產細菌素的菌株添加于食品中以達到控制病源微生物和腐敗微生物、提高安全性的目的。目前商品化的乳酸菌細菌素主要有 Nisin 和片球菌素［3-4］。

植物乳桿菌是一種重要的益生菌，通過體外實驗、模式動物和人體實驗表明:植物乳桿菌對人體健康具有多種潛在的益生作用，包括調節(jié)宿主免疫系統(tǒng)［5-6］、競爭排斥病源微生物［7］、產生抗細菌物質［8］(如細菌素)、產生短鏈脂肪酸、氨基酸和維生素等［9］。2007年3月，光明乳業(yè)成功將植物乳桿菌STIII應用于暢優(yōu)酸奶中，這為植物乳桿菌在酸奶中的廣泛應用奠定了堅實的基礎。

本實驗研究的植物乳桿菌KLDS1.0391是實驗室前期從內蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品“焦克”中分離得到，所產的細菌素有抑菌譜廣，對酸、堿、熱穩(wěn)定的特點［10］，并且安全無毒，小鼠的最高耐受劑量大于15 g/kg體重;30天喂養(yǎng)實驗證明，長時間攝入細菌素不會對小鼠產生明顯的損傷［11］。本研究的目的是在酸奶發(fā)酵時添加植物乳桿菌KLDS1.0391，研究在酸奶發(fā)酵和貯藏過程中，細菌素生物活性的變化情況，以及添加植物乳桿菌對酸奶品質的影響，從而為該菌株應用于酸奶生產提供理論基礎。

1 材料設備與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及發(fā)酵劑

植物乳桿菌KLDS1.0391，來自乳品科學教育部重點實驗室(東北農業(yè)大學)工業(yè)微生物菌種保藏中心(KLDS-DICC);枯草芽孢桿菌ATCC6633購自中國藥品生物制品檢定所，作為測定細菌素抑菌活性的指示菌;商業(yè)酸奶發(fā)酵劑(只含德氏乳桿菌保加利亞亞種和嗜熱鏈球菌)，購自法國普爾斯公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

采用MRS培養(yǎng)基［12］培養(yǎng)植物乳桿菌KLDS1.0391，采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基［13］培養(yǎng)枯草芽孢桿菌ATCC6633。

1.1.3 主要試劑

酵母提取物(英格蘭Oxoid公司)，蛋白胨(英格蘭Oxoid公司)，胰蛋白胨(英格蘭Oxoid公司)，過氧化氫酶(美國Sigma公司)，其他試劑均為國產分析純或生化純。

1.1.4 儀器與設備

GL-21M高速冷凍離心機，上海市離心機械研究所;BCN1360型生物潔凈工作臺，上海佳勝實驗設備有限公司;HIRAYAMA HVE-50形高壓滅菌器，日本HIRAYAMA公司;徠卡DMLB型顯微鏡，德國徠卡顯微鏡與系統(tǒng)公司;SPX-150B生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司;LGJ-1冷凍干燥機，上海醫(yī)用分析儀器廠。

1.2 菌株的活化與培養(yǎng)

植物乳桿菌KLDS1.0391于-80℃冰箱中冷凍保存，使用前將凍存菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，活化傳代2次，每次分別于37℃培養(yǎng)12 h。活化好的菌液分別接入12%的脫脂乳中活化2代后備用。

枯草芽孢桿菌活化2代后，以1%接種量接種到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18 h，備用。

1.3 酸奶的制作

設1個實驗組和1個對照組。實驗組為商業(yè)酸奶發(fā)酵劑+植物乳桿菌KLDS1.0391，對照組只使用商業(yè)酸奶發(fā)酵劑。

酸奶制作工藝:原料乳→預熱至50℃→加入6.5%白砂糖混合10 min→巴氏殺菌(85℃，5 min)→冷卻至42℃加入商業(yè)發(fā)酵劑(4U/100 kg)及植物乳桿菌KLDS1.0391(1%接種量)后恒溫42℃發(fā)酵→至對照組pH值達4.7時結束發(fā)酵，迅速冰浴冷卻→4℃后熟 24 h［14］。

1.4 酸奶發(fā)酵及貯藏過程中相關指標的測定

發(fā)酵過程中，每隔1 h測定1次酸奶的pH、滴定酸度、抑菌活性以及保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌的活菌數(shù)。

發(fā)酵結束后，酸奶于4℃下貯藏21 d，每3 d測定1次酸奶的pH值、滴定酸度、抑菌活性以及保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、植物乳桿菌的活菌數(shù)，每7 d對酸奶進行1次感官評定［15］。

1.5 pH值及滴定酸度的測定

采用精密pH計于室溫下測定試樣pH值，滴定酸度根據(jù)GB/5413.34-2010，酸度數(shù)值以(°T)表示。

1.6 抑菌活性的測定

1.6.1 無細胞上清液的制備

乳酸菌發(fā)酵液經12 000×g，4℃離心15 min，收集上清液，用6 mol/L NaOH調pH到7.0，以中和有機酸的干擾。過氧化氫酶溶解在0.02 mol/L的乙酸鈉緩沖液(pH 7.0)中配成母液(100 mg/mL)，加入無細胞發(fā)酵上清液中，使過氧化氫酶的終濃度為5.0 mg/mL，37℃水浴2 h后取出，以排除過氧化氫的干擾。上清液用0.22 μm濾膜過濾，除去菌體及其它雜質，再經冷凍干燥，凍干后加入原體積1/10的MilliQ水，溶解后放入-20℃冰箱中備用［16-17］。

1.6.2 細菌素的抑菌圈直徑的測定

采用雙層平板打孔法測定細菌素的抑菌圈直徑，操作如下:首先制備雙層瓊脂平板培養(yǎng)基，其中上層瓊脂培養(yǎng)基含有指示菌。用打孔器打孔(直徑6 mm)，在孔中加入50 μL無細胞上清液，室溫條件下放置3 h，然后置于適宜條件下進行培養(yǎng)，用游標卡尺測量抑菌圈直徑(不含孔徑)。通過抑菌圈直徑的大小反映抑菌活性［18］。

1.7 活菌數(shù)的測定

采用平板菌落計數(shù)法計數(shù)活菌數(shù)。取25 g酸奶樣品至225 mL帶玻璃珠的無菌生理鹽水中，充分混勻，即為1∶10的稀釋液，吸取1∶10稀釋液1 mL，注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內，振搖試管混合均勻，制成1∶100稀釋液，依次進行梯度稀釋;選擇3個適當?shù)南♂屘荻?，?00 μL稀釋液分別涂布于山梨 醇-MRS［19］、M17(加 0.5% 乳 糖)［20］、MRS(pH 5.2)［21］固體平板上，每個稀釋度做3個平行。MRS平板于45℃厭氧培養(yǎng)72 h，山梨醇-MRS平板于37℃厭氧培養(yǎng)72 h，M17平板于45℃培養(yǎng)48 h。從M17平板上計數(shù)嗜熱鏈球菌，從山梨醇-MRS平板上計數(shù)植物乳桿菌，從MRS平板上計數(shù)保加利亞乳桿菌。

表1 酸奶樣品感官評價評分指標和評分標準Table 1 Sensory description and evaluation indexes for the yoghourt

1.8 感官評定

選擇3名男性和7名女性共10人，年齡在22～32歲，進行感官評定，分別從外觀、口感和滋氣味3個方面進行評定。評分標準如表1所示。

感官評價得分采用10分制，其中0～2分代表特征強度較弱，3～6分代表特征強度中等，7～10分代表特征強度較強［21］。

1.9 統(tǒng)計學方法

應用 Oringin7.5、SPSS17、Excel2003等軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析。

2 結果與分析

2.1 酸奶發(fā)酵期間的特點

2.1.1 酸奶發(fā)酵過程中的pH值及滴定酸度變化

酸奶發(fā)酵過程中pH值及滴定酸度的變化見表2。結果顯示，6 h為發(fā)酵終點，達到發(fā)酵終點時，對照組的pH為4.7，而實驗組為4.6。滴定酸度隨發(fā)酵時間的延長而提高，發(fā)酵至3～4 h時，實驗組滴定酸度高于對照組(P＜0.05)，發(fā)酵至5～6 h時，實驗組的滴定酸度顯著高于對照組(P＜0.01)。

表2 酸奶發(fā)酵過程中pH值及滴定酸度的變化Table 2 Changes of pH value and acidity during fermentation of yoghourt

2.1.2 酸奶發(fā)酵過程中的乳酸菌活菌數(shù)的變化

酸奶在發(fā)酵過程中，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及植物乳桿菌的活菌數(shù)變化見圖1。結果顯示，發(fā)酵過程中，實驗組嗜熱鏈球菌活菌數(shù)與對照組無顯著差異(P＞0.05)，達發(fā)酵終點時，實驗組保加利亞乳桿菌活菌數(shù)顯著低于對照組(P＜0.05)，但2組的總活菌數(shù)都大于1.0×109CFU/mL。

2.1.3 酸奶發(fā)酵過程中的抑菌活性變化

酸奶發(fā)酵過程中細菌素合成量的變化見圖2。結果顯示，抑菌圈直徑隨發(fā)酵時間的延長而增大，與圖1對比得知:從第5小時開始，實驗組的抑菌活性顯著高于對照組(P＜0.05)。

圖1 酸奶發(fā)酵過程中乳酸菌活菌數(shù)的變化Fig.1 The changes of cell numbers of LAB during fermentation of yoghourt

圖2 酸奶發(fā)酵過程中抑菌活性的變化Fig.2 The changes of inhibitory activity during fermentation of yoghourt

2.2 酸奶貯藏期間的特點

2.2.1 酸奶貯藏過程中的pH值及滴定酸度變化

酸奶在4℃條件下貯藏過程中的pH值及滴定酸度的變化見表3。結果顯示，21 d貯藏期間，實驗組與對照組酸奶的pH均持續(xù)下降。4℃貯藏21 d后，對照組pH達4.4，實驗組pH達4.2;實驗組滴定酸度顯著高于對照組(P＜0.05)。

表3 酸奶4℃貯藏過程中pH值及滴定酸度的變化Table 3 Changes of pH value and acidity during storage of yoghourt at 4℃

2.2.2 酸奶貯藏過程中的活菌數(shù)變化

酸奶在貯藏過程中保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及植物乳桿菌的活菌數(shù)變化見圖3。結果顯示，貯藏21 d過程中，保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌及植物乳桿菌的活菌數(shù)有不同程度的下降，但兩組酸奶的總活菌數(shù)都大于1.0×108CFU/mL。貯藏21 d后，保加利亞乳桿菌及嗜熱鏈球菌的活菌數(shù)均下降1個數(shù)量級，植物乳桿菌KLDS1.0391耐酸性較強，其活菌數(shù)始終維持在107CFU/mL以上。

2.2.3 酸奶貯藏過程中的抑菌活性的變化

酸奶在貯藏過程中，所產細菌素的抑菌活性的變化情況見圖4。結果顯示，21 d貯藏過程中，對照組與實驗組的抑菌活性均呈緩慢下降趨勢，說明在貯藏過程中，細菌素的抑菌活性逐漸下降;在貯藏的前18 d，實驗組的抑菌活性顯著高于對照組(P＜0.05)，之后差異不顯著(P＞0.05)。

2.2.4 酸奶貯藏過程中的感官評價

主要從外觀、口感及風味等方面對酸奶進行感官評價，繪制的蛛網圖見圖5。由圖5可知，隨貯藏時間的延長，酸奶在口中的融化速度變慢，苦味有所增加，但都在可接受范圍內。貯藏期間實驗組酸奶的表觀稠度、光滑度、口感光滑度、口感粘稠度及奶油感與對照組差別不明顯，說明加入輔助發(fā)酵劑沒有對酸奶的感官品質產生很大影響。

3 結論

圖3 酸奶貯藏過程中乳酸菌活菌數(shù)的變化Fig.3 The changes of cell numbers of LAB during storage of yoghourt

圖4 酸奶貯藏過程中抑菌活性的變化Fig.4 The changes of inhibitory activity during storage of yoghurt

酸奶發(fā)酵過程中，添加植物乳桿菌KLDS1.0391的實驗組發(fā)酵速度稍快于對照組，達發(fā)酵終點時，兩組酸奶的總活菌數(shù)均達1.0×109CFU/mL以上，實驗組抑菌活性顯著高于對照組(P＜0.01)。

圖5 貯藏過程中酸奶感官評價Fig.5 The results of sensory evaluation of yoghourt during storge

在貯藏過程中，2組酸奶均組織細膩、均勻，表面光滑無裂痕，無異味，添加植物乳桿菌KLDS1.0391的實驗組與對照組在感官上無顯著差異。在21 d的貯藏期間，2組酸奶的總品質活菌數(shù)均大于108CFU/mL，實驗組滴定酸度顯著高于對照組(P＜0.05)。在貯藏的前18 d，實驗組的抑菌活性顯著高于對照組(P＜0.05)，之后差異不顯著。植物乳桿菌KLDS1.0391具備開發(fā)益生酸奶的潛力。

［1］ Bowdish D M E，Davidson D J，Hancock R E W.A re-evaluation of the role of host defence peptides in mammalian immunity［J］.Current Protein and Peptide Science，2005，6:35-51.

［2］ Cotter P D，Hill C，Ross R P.Food microbiology:Bacteriocins:developing innate immunity for food［J］.Nature Reviews Microbiology，2005，3(10):777-788.

［3］ Sobrino-lópez A，Martín-belloso O.Use of nisin and other bacteriocins for preservation of dairy products［J］.International Dairy Journal，2008，18(4):329-343.

［4］ Anastasiadou S，Papagianni M，F(xiàn)iliousis G，et al.Pediocin SA-1，an antimicrobial peptide from Pediococcus acidilactici NRRL B5627:production conditions，purification and characterization［J］.Bioresource Technology，2008，99(13):5 384-5 390.

［5］ Cunningham-rundles S，Ahrne S，Bengmark S，et al.Probiotics and immune response［J］.The American Journal of Gastroenterology，2000，95(1):22-25.

［6］ Mccracken V J，Chun T，Baldeon M E，et al.TNF-αSensitizes HT-29 colonic epithelial cells to intestinal Lactobacilli［J］.Experimental Biology and Medicine，2002，227(8):665-670.

［7］ Maragkoudakisa P A，Georgia Z，Miaris C，et al.Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products［J］.International Dairy Journal，2006，16(3):189-199.

［8］ Gong H S，Meng X C，Wang H.Plantaricin MG active against gram-negative bacteria produced by Lactobacillus plantarum KLDS1.0391 isolated from“Jiaoke”，a traditional fermented cream from China［J］.Food Control，2010，21(4):89-96.

［9］ 劉勇.植物乳桿菌益生特性及產共軛亞油酸能力研究［D］.呼和浩特:內蒙古農業(yè)大學，2010.

［10］ Gong H S，Meng X C，Wang H.Mode of action of plantaricin MG，a bacteriocin active against Salmonella typhimurium［J］.Journal of Basic Microbiology，2010，50(1):37-45.

［11］ 貢漢生.植物乳桿菌KLDS1.0391所產細菌素的分離純化與部分特性［D］.哈爾濱:東北農業(yè)大學，2009.

［12］ Maldonado A，Ruiz-barba J L，Jiménez-díaz R.Production of plantaricin NC8 by Lactobacillus plantarum NC8 is induced in the presence of different types of gram-positive bacteria［J］.Archives of Microbiology，2004，181(1):8-16.

［13］ Man L L，Meng X C，Zhao R H.Induction of plantaricin MG under co-culture with certain lactic acid bacterial strains and identification of LuxS mediated quorum sensing system in Lactobacillus plantarum KLDS1.0391［J］.Food Control，2012，23(2):462-469.

［14］ 孔保華，張?zhí)m威.乳品科學與技術［M］.北京:科學出版社，2008:199-202.

［15］ Berrocal D，Arias M L，Henderson M，et al.Evaluation of the activity of probiotic cultures over Listeria monocytogenes during the production and storage of yoghourt［J］.Arch Latinoam Nutr，2002，52(4):375-380.

［16］ Somkuti G A，Steinberg D H.Pediocin production in milk by Pediococcus acidilactici in co-culture with Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus［J］.J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37(1):65-69.

［17］ Collado M C，Gonzalaz A，Gonzalaz R.Antimicrobialpeptides are among the antagonistic metabolites produced by Bifidobacterium against Helicobacter pylori［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2005，25:385-391.

［18］ Rojo-bezares B，Seanz Y，Navarro L，et al.Coculture-inducible bacteriocin activity of Lactobacillus plantarum strain J23 isolated from grape must［J］.Food Microbiology，2007，24(5):482-491.

［19］ Karimi R，Mortazavian A M，Amiri-rigi A.Selective enumeration of probiotic microorganisms in cheese［J］.Food Microbiology，2012，29(1):1-9.

［20］ 韓瑨，花陳劍，王蔭榆.植物乳桿菌ST-Ⅲ的生長特性與保存性能研究［J］.中國乳品工業(yè)，2010，38(4):4-6.

［21］ 凌代文.乳酸菌分類鑒定及試驗方法［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1999:6-15.

［22］ 尚玉琳，孟祥晨.不同酸奶發(fā)酵劑的發(fā)酵性能比較［J］.食品科技，2011(10):41-45.