李潔，竇文芳，李會，史勁松，許正宏，李華鐘

1(江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122)2(江南大學 醫(yī)藥學院，江蘇 無錫，214122)

微生物胞外多糖是一種長鏈的大分子聚合物，具有獨特的物理性質(zhì)、流變學特性和較好的安全性，生產(chǎn)不受地域生態(tài)環(huán)境和季節(jié)因素的影響，在食品、日化、紡織、醫(yī)藥和廢水處理等領域的應用潛能日益引起人們的關注［1］。目前已應用于食品領域的微生物胞外多糖有透明質(zhì)酸、黃原膠、阿拉伯膠、細菌纖維素、小核菌葡聚糖、短梗霉多糖、熱凝多糖等［2］。隨著微生物胞外多糖應用領域的不斷拓寬，每年對多糖的需求量不斷增大，越來越多的國內(nèi)外學者致力于開發(fā)和研究具有應用潛能的微生物胞外多糖。

膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖(EPS)是一種由膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)在微氮培養(yǎng)基上產(chǎn)生的高黏性莢膜多糖。研究表明EPS在礦業(yè)、農(nóng)業(yè)、化工等領域已有廣泛的應用，周吉奎等人報道［3］EPS可作為生物礦化劑，釋放含鉀及磷礦物中的鉀、磷及其它灰分;連賓等人報道［4］EPS既可作為一種高效、無毒、無二次污染的生物絮凝劑;同時EPS還可作為陶瓷工業(yè)的添加劑，改善高嶺土的彎曲強度和其它性質(zhì)等。目前關于發(fā)酵法制備EPS及其性質(zhì)的研究鮮見報道，這使其在食品、精細化工、制藥、印染等相關領域的應用受到限制，因此研究其生物合成、結構、物理化學特性就顯得尤為重要。

本實驗室前期從自然界中篩選獲得1株具有良好生產(chǎn)EPS能力的膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01(保藏號為CGMCC5766)。該菌在以蔗糖、尿素為碳氮源及一些無機鹽組成的培養(yǎng)基中發(fā)酵產(chǎn)生高黏性發(fā)酵液，經(jīng)乙醇沉淀、離心、干燥，得到EPS干品。EPS溶液在低濃度時即具有很高的黏度、優(yōu)良的流變學特性與穩(wěn)定性。EPS分子質(zhì)量相對均一(約600萬Da)，該特點明顯優(yōu)于其他已工業(yè)化應用的黃原膠、威蘭膠、細菌纖維素等多糖，可簡化后期分離純化過程。本文主要研究了EPS的發(fā)酵過程、制備方法及流變學特性，這是其流變學特性研究的首次報道，為EPS作為增稠劑、懸浮劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等應用于食品和日化領域提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及試劑

菌株Bacillus mucilaginosus SM-01，江南大學醫(yī)藥學院制藥工程實驗室分離并保藏;間羥基聯(lián)苯，購自西域公司;濃H2SO4、四硼酸鈉、NaOH、無水乙醇等化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面培養(yǎng)基(L):蔗糖10 g，(NH4)2SO40.1 g，CaCO32 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.2 g，NaCl 0.2 g，瓊脂 15 g，pH 7.0 ～7.2。

(2)種子培養(yǎng)基(L):蔗糖 10 g，尿素 0.1 g，Ca-CO35 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，K2HPO40.2 g，NaCl 0.2 g，pH 7.0 ～7.2。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基(L):蔗糖 60 g，尿素 0.3 g，Ca-CO35 g，MgSO4·7H2O 0.6 g，K2HPO40.2 g，NaCl 0.4 g，pH 7.0 ～7.2。

1.2 儀器與設備

722型分光光度計，尤尼可上海儀器有限公司;CR22GII冷凍高速離心機，日本日立公司;SPX-250型生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠;真空冷凍干燥機，美國Labconco公司;DK-8D型電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)用恒溫設備廠;DV-C黏度計，美國Brookfield公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 膠質(zhì)芽孢桿菌的培養(yǎng)

將斜面保藏的菌種于平板上劃線，30℃恒溫培養(yǎng)24 h，活化2次，將活化后的種子接種到種子培養(yǎng)基中，32℃、200 r/min培養(yǎng)24～28 h，再將此種子按4%的接種量接入到5 L罐中，30℃、500 r/min、1 vvm發(fā)酵培養(yǎng)68 h，定時取樣測定菌濃、多糖產(chǎn)量、pH并獲取發(fā)酵液。

1.3.2 EPS的的分離提取

發(fā)酵液→稀釋2～3倍→離心(20 min，8 000 r/min，4℃)→濃縮上清液→加入3倍體積95%的乙醇→4℃靜置過夜→離心(10 min，5 000 r/min，4℃)→沉淀復溶→乙醇重復抽提→冷凍干燥所得沉淀→多糖

1.3.3 測定方法

① 菌濃測定:取發(fā)酵液1 mL，稀釋2～4倍，725型分光光度計在600 nm下測其吸光值。

②多糖含量的測定:精確稱取1 g發(fā)酵液，稀釋2倍，8 000 r/min離心10 min去除菌體，上清液中加入2倍質(zhì)量的95%乙醇，充分振蕩至出現(xiàn)絮狀沉淀，4℃保溫過夜，離心去除上清液得粗品，沉淀物60℃真空干燥至恒重，電子天平稱重。

③pH測定:采用精密pH計測定。

1.3.4 EPS溶液流變學特性測定

準確稱取一定量經(jīng)冷凍干燥的EPS，充分溶解，配制成0.5%的溶液，分別測定不同轉(zhuǎn)速(0.3～100 r/min)、質(zhì)量濃度(1.0～5.0 g/L)、剪切時間(0～900 s)、溫度(25℃，40℃，60℃，80℃，100℃)、pH 值(2，3，5，7，9，11)、無 機 鹽 (NaCl，KCl，CaCl2，MgCl2，Pb(NO3)2，F(xiàn)eCl3)、其它生物高分子多糖(海藻酸鈉，瓜爾膠，槐豆膠，阿拉伯膠，黃原膠)對其表觀黏度的影響。

實驗中表觀黏度的測定，采用DV-C黏度計于25℃、2號轉(zhuǎn)子、20 r/min條件下進行，2 min后待讀數(shù)穩(wěn)定讀出其黏度值。黏度相對值的計算公式:

2 結果與分析

2.1 SM－01胞外多糖發(fā)酵及制備

在含蔗糖60 g/L、尿素0.3 g/L及其一些無機鹽組成的培養(yǎng)基中，對SM-01進行5 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，分析發(fā)酵過程中的pH、菌濃、EPS產(chǎn)量的變化。結果表明(圖1)，0～12 h為菌體緩慢生長的延遲期;12～48 h為菌體快速生長的對數(shù)期，菌濃在48 h時達到最大，OD600為2.8;48～60 h為菌體生長的穩(wěn)定期，EPS在60 h時可達到最大值23.46 g/L，表明此菌的生長與代謝產(chǎn)物多糖合成表現(xiàn)為生長偶聯(lián)的關系;從整個發(fā)酵過程的pH值變化來看，雖然培養(yǎng)基中加入了CaCO3，但pH值仍略呈下降趨勢，推測菌體在生長過程會產(chǎn)酸;發(fā)酵60 h后，菌體開始進入衰亡期，菌濃和多糖產(chǎn)量均有所下降，可能是由于培養(yǎng)基黏度增大導致供氧不足造成的。由于多糖的積累不利于菌濃的提高，因此可以借鑒許喜林等［5］采用的“先用氮源豐富的培養(yǎng)基提高生物量，再于無氮培養(yǎng)基中發(fā)酵積累黃原膠”的方法，提高EPS的產(chǎn)量。根據(jù)1.3.2中EPS的分離提取方法可得到海綿狀EPS固體，其回收率可達76.7%。

圖1 膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01產(chǎn)多糖的發(fā)酵過程曲線Fig.1 The curve of growth of SM-01

2.2 EPS溶液流變學特性的研究

2.2.1 剪切速率對EPS溶液黏度的影響

研究了不同轉(zhuǎn)速對0.5%EPS溶液黏度的影響。結果表明(圖2)，0.5%的EPS溶液符合典型的非牛頓流體的假塑性行為特征——對剪切力敏感，隨著剪切速率的增加，溶液黏度顯著下降［6］。由于該多糖的分子質(zhì)量在600萬Da以上，溶液在靜止或低轉(zhuǎn)速時分子會相互纏結黏度較大;隨著轉(zhuǎn)速的增大，分子間的剪切應力變大，就出現(xiàn)表觀黏度隨剪切速率減小的假塑性，這一性質(zhì)與威蘭膠和透明質(zhì)酸等相似［7-8］。

圖2 剪切速率對EPS溶液黏度的影響Fig.2 Effects of shearing rate on viscosity

2.2.2 濃度對EPS溶液黏度的影響

研究了不同質(zhì)量濃度EPS溶液黏度的變化。結果表明(圖3)，在25℃、2號轉(zhuǎn)子、20 r/min的條件下，0.1%的溶液黏度約為0.017 Pa·s，而0.5%的溶液黏度就已達到0.133 Pa·s，黏度提高了約100倍。同時經(jīng)測定2%的溶液已趨于凝膠化，流動性很差?？赡苁且驗镋PS質(zhì)量濃度的增大加強了多糖鏈之間的相互作用，從而使溶液黏度提高［9］。

圖3 濃度對EPS溶液黏度的影響Fig.3 Effect of EPS concentration on EPS solution viscosity

對于非牛頓流體而言，黏度和剪切速率(或轉(zhuǎn)速)之間的關系可以用Ostward-dewele的冪律黏度模型表示，其表達式為:ηα=K·γ(n-1)［10］，當溶液濃度由0.1%增加到0.5%時，對圖3中的曲線進行擬合，可以得到K值從0.053增加到0.672;n值從0.62降低到0.47，表明EPS溶液黏度越大假塑性越強(圖3)。

2.2.3 剪切時間對EPS溶液黏度的影響

研究了不同的剪切時間對0.5%的EPS溶液黏度的影響。如圖4所示，在0～900 s的范圍內(nèi)0.5%的EPS溶液黏度維持在0.133～0.136 Pa·s，可見EPS溶液黏度隨剪切時間的延長基本不發(fā)生變化。表明多糖分子與水分子以及多糖分子之間的相互作用相對穩(wěn)定，其穩(wěn)定性優(yōu)于乳酸菌所產(chǎn)多糖［11］。此外，還研究了EPS溶液長期靜置后的黏度變化。結果表明，20℃下靜置60 d后，EPS溶液黏度變化在2.0%以內(nèi)，表現(xiàn)出良好的貯存穩(wěn)定性。因此，將EPS作為溶液增稠劑或顆粒分散劑有一定的優(yōu)勢。

圖4 剪切時間對EPS溶液黏度的影響Fig.4 Effects of shearing time on viscosity

2.2.4 溫度對EPS溶液黏度的影響

研究0.5%的EPS溶液在25～100℃表觀黏度的變化情況，為確保實驗結果的準確性，將表觀黏度換算成黏度相對值(圖5)。結果顯示，溶液表觀黏度隨著溫度升高降低較為緩慢，當溫度再次降至25℃時，黏度能夠基本恢復;但0.5%的EPS溶液在100℃加熱30 min后，表觀黏度會從0.38 Pa·s下降到0.08 Pa·s，黏度會下降67%。表明長時間高溫加熱可以降低大分子多糖的分子量或者改變其分子結構，分子無規(guī)則卷曲解體，從而使溶液的黏度下降［12］。因此，當EPS應用于食品行業(yè)時，應選擇高溫瞬時滅菌［13］。

圖5 溫度對EPS溶液黏度的影響Fig.5 Effects of temperature on viscosity

2.2.5 pH對EPS溶液黏度的影響

研究EPS溶液的表觀黏度在pH 2～11的變化情況(圖6)。結果顯示，在中性范圍內(nèi)溶液黏度保持相對穩(wěn)定，而在酸性或較強的堿性條件下，黏度有較大幅度的變化。如pH=2時溶液黏度相對值約為65%，當體系pH ＞12時，EPS溶液呈現(xiàn)弱凝膠化，推測大分子之間的相互作用發(fā)生了根本改變［14］。EPS在堿性條件下形成凝膠的特性與海藻酸鈉、阿拉伯膠、刺槐豆膠及黃原膠等生物高分子多糖極為相似［15］。

圖6 pH值對EPS溶液黏度的影響Fig.6 Effects of pH on viscosity

2.2.6 無機鹽種類對EPS溶液黏度的影響

研究 NaCl、MgCl2、CaCl2、KCl、FeCl3、Pb(NO3)2分別為1%，3%，5%，7%時對EPS溶液表觀黏度的影響，并將表觀黏度值換算成黏度相對值。結果顯示(表1)，不同無機鹽離子的加入均會導致溶液表觀黏度的下降，并且隨著離子濃度的增加其黏度呈下降趨勢，其中Mg2+和Ca2+導致溶液表觀黏度下降的趨勢更加顯著。表明無機鹽可能會降低EPS溶液分子間的電荷力，造成溶液黏度下降。同時研究中還發(fā)現(xiàn)，鈣、鎂鹽可以與EPS在pH ＞11的情況下形成凝膠;中性pH范圍內(nèi)，F(xiàn)eCl3和Pb(NO3)2加入到EPS溶液后會促進多糖絮凝，出現(xiàn)橘黃色和白色沉淀，這與黃原膠的性質(zhì)很相似［14］。有報道大分子多糖在工業(yè)廢水處理中已顯示出了廣闊的應用前景［16-17］。并且實驗已經(jīng)證實了EPS溶液確實具有良好的絮凝效果，后續(xù)試驗也已經(jīng)展開。

表1 無機鹽對EPS溶液黏度的影響Table 1 Effects of inorganic salt on viscosity

2.2.7 其他多糖膠對EPS溶液黏度的影響

分別將濃度為0.5%的海藻酸鈉、阿拉伯膠、瓜爾膠、黃原膠、槐豆膠溶液與同濃度的EPS溶液1∶1復配，復配溶液黏度均增加，其中EPS與阿拉伯膠復配后黏度提高了近1倍(表2)。表明EPS中的雙螺旋結構易和含β-1，4鍵的其它多糖分子發(fā)生不同程度的嵌合作用，造成復配后溶液黏度發(fā)成不同程度的提高［17］。因此如將多糖復配后開發(fā)用于食品行業(yè)，既可以減少糖的用量又可以達到很好的增稠效果;同時EPS與殼聚糖溶液混合后會產(chǎn)生沉淀，在這一點上EPS與其它陰離子多糖性質(zhì)一致［11］。

表2 EPS與其它種類多糖復配后溶液黏度的變化Table 2 Effects of other EPSs on viscosity

3 結論

本文利用實驗室保藏的1株膠質(zhì)芽孢桿菌SM-01發(fā)酵生產(chǎn)多糖(EPS)，5L發(fā)酵罐發(fā)酵后EPS的產(chǎn)量最高可達23.46 g/L，發(fā)酵液經(jīng)稀釋、離心、醇沉后EPS的回收率為76.7%。

本文是國內(nèi)外關于膠質(zhì)芽孢桿菌胞外多糖(EPS)流變學特性研究的首次報道，為拓寬EPS的應用領域有重要意義。EPS是一種高分子量、高黏度多聚物，其水溶液表現(xiàn)為典型的非牛頓流體特性，具有良好的流變學特性;在25～100℃ EPS溶液具有良好的耐熱性;該溶液在微酸性、中性和微堿性條件下黏度相對穩(wěn)定，這符合日化行業(yè)對pH的要求，因此EPS可作為增稠劑、懸浮劑、保濕劑和乳化劑應用于化妝品行業(yè)。EPS與其它食品中廣泛應用的多糖復配時有很好的協(xié)效性，此優(yōu)良特性使多糖在食品方面有也具有很廣闊的應用前景。

［1］ Canquil N，Villarroelm，BravoS，et al.Behavior of the rheological parameters of exopolysaccharides synthesized by three lactic acid bacteria［J］.Carbohydrate Polymers，2007，68(2):270-279.

［2］ Kumar AS，Mody K，Jha B.Bacterial exopolysaccharidesa perception ［J］.Journal of Basic Microbiology，2007，47(2):103-117.

［3］ 周吉奎，胡岳華，邱冠周.硅酸鹽細菌在礦物工程領域應用研究進展［J］.金屬礦山，2002(1):26-28.

［4］ 連賓，陳燁，袁生等.硅酸鹽細菌GY03菌株的絮凝特性［J］.礦物學報，2003(4):303-307.

［5］ 許喜林，司徒海峰，陳維鈞.除細胞法產(chǎn)生黃原膠［J］.食品科學，1998，25(1):11-15.

［6］ Abuin A G，Diaz D G，Navazm JM，et al.Viscosimetric behaviour of hyaluronic acid in different aqueous solutions［J］.Carbohydrate Polymers，2011，85(3):500-505.

［7］ 陳芳，李建科，徐昶.新型微生物多糖—韋蘭膠的流變特性影響因素研究［J］.食品科學，2007，28(9):49-52.

［8］ Isobe Y K，Endo K J，Kawai H.Properties of a highly viscous polysaccharide produced by a bacillus strain isolated from soil［J］.Biosci Biotech Biochem，1992，56(4):636-639.

［9］ Vitor D，Alves，F(xiàn) F，Cristiana A V.et al.Rheological and morphological of the culture broth during exopolysaccharide production by Enterobacter sp.［J］.Carbohydrate Polymers，2010，48(3):758-764.

［10］ 賈薇，鄭志永，劉汝冰，等.一種新型微生物多糖流變學初探［J］.食品科學，2009，30(1):135-138.

［11］ Diaz D G，Navaza J M，Riveio L C Q.Intrinsic viscosity and flow behavior of arabic gum aqueous solutions［J］.International Journal of Food Properties，2008，11(4):773-780.

［12］ 周林，郭祀遠，蔡妙顏，等.裂褶菌胞外多糖的黏度性質(zhì)及其構象研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(11):1-5.

［13］ 楊貞耐，張雪.乳酸菌胞外多糖的流變學特性和分子結構修飾［J］.食品科學，2007，28(12):535-538.

［14］ Kang KS，Pettit DJ.Industrial gums［M］.New York:AcademicPress，1993:341-398.

［15］ Bin L，Chen Y.Microbial flocculation by Bacillus mucilaginosus，applications and mechanisms［J］.Bioresource Technology，2008，99(11):4825-483.

［16］ Deng S B，Bai R B.Characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosusand its use in starch wastewater treatment［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2003，60(5):588-593.

［17］ 陳志行，周莉，陳小輝.黃原膠與魔芋膠混膠黏度的影響因素研究［J］.食品與機械，2003(1):14-16.