葛躍，吳潔，趙昀

(蘇州大學唐仲英血液學研究中心，江蘇蘇州 215123)

人類慢性髓細胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是源自造血干細胞的惡性血液腫瘤。依據(jù)疾病的進程可分為慢性期、加速期和急變期3個階段。伊馬替尼(imatinib methylate，IM)可抑制酪氨酸激酶(BCR-ABL)活性，在慢性期慢性粒細胞白血病治療中有效，但很難達分子學緩解(MR)［1］，無法治愈該疾病。因而，尋找新靶點、設計新藥物成為CML研究領域的熱點［2］。

1988年Schneider等［3］鑒定到一組在 NIH 3T3細胞處于血清饑餓或細胞接觸性抑制狀態(tài)而表達上調(diào)的基因，稱之為生長抑制特異性基因(growth arrestspecific genes，GAS)。它們編碼的蛋白產(chǎn)物包括Gas1、Gas2……Gas8等，但它們不存在序列同源性或共同結構特征，細胞定位和功能也各異［4］。Gas2蛋白產(chǎn)物包含N-端的CH(calponin homology)結構域和C-端的GAR結構域。Gas2是微絲、微管相關蛋白，參與細胞分裂的調(diào)控［5］，比如，Gas2和N-端缺失的Gas2變體能抑制爪蟾胚胎細胞的生長［6］。Gas2也是Caspase的底物參與細胞凋亡［7］。另外，Gas2還是鈣蛋白酶Calpain的內(nèi)源性抑制劑，可通過抑制Calpain的活性、穩(wěn)定p53而調(diào)控凋亡反應［8］。

Gas2在人類骨髓增生性疾病中異常表達，這類疾病包括 IM(idiopathic myelofibrosis，骨髓纖維化)、PV(polycythemia vera，真性紅細胞增多癥)、ET(essential thrombocythemia，原發(fā)性血小板增多癥)和 CML等。Kronenwett等［9］使用 CML患者與正常骨髓及 G-CSF動員的外周血CD34+細胞進行基因表達譜研究，結果提示Gas2在CML患者中較正常細胞表達增高。此外，兩項獨立研究顯示在CML從慢性期到急變期的轉(zhuǎn)化過程中，Gas2的表達隨疾病的進程升高［10-11］。Vannucchi等［12］比較IM患者與正常供體CD34+細胞的基因表達譜，發(fā)現(xiàn)Gas2高表達;而后使用IM、PV及ET患者與正常供體骨髓的CD34+細胞進行Q-RTPCR驗證，證實Gas2在這3種疾病中都顯著較正常細胞表達增高。

Gas2Δ171-314和Calpain結合但不抑制其活性，卻解除Gas2和內(nèi)源性抑制劑Calpastatin對Calpain的抑制作用［8］，因而被稱為 Gas2的顯性負性突變體(Gas2DN)。在多種腫瘤細胞中Calpain能獨立于GSK3β/蛋白酶體途徑調(diào)控 β-catenin 的降解［13］;Huang等［14］發(fā)現(xiàn) Gas2Δ171-314 能激活細胞內(nèi)被 Gas2 或Calpastatin抑制的 Calpain活性，促進 β-catenin的降解，從而抑制BCR-ABL+的U937細胞或小鼠骨髓祖細胞響應GM-CSF刺激的細胞增殖，這與Calpain活化、β-catenin降解及其轉(zhuǎn)錄活性的降低相關。

本研究使用慢病毒在人慢性髓細胞白血病K562細胞株中過表達 Gas2、Gas2Δ171-313和 Gas2Δ1-170，研究它們能否對K562細胞增殖有抑制作用，這種抑制作用對細胞周期、凋亡和衰老的影響，這種抑制作用能否與IM具有協(xié)同性。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人慢性髓細胞白血病細胞株K562和人胚腎293T細胞購于中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫。

1.1.2 主要試劑 Ex Taq DNA聚合酶、pMD19-T載體、T4DNA 連接酶、XhoI、EcoRI、BamHI、XbaI、PstI、HindⅢ、BglⅡ限制性內(nèi)切酶均購于 TaKaRa公司。PCR引物合成及基因序列檢測均由上海生工生物工程公司完成。鼠抗人單克隆 α-Tubulin抗體購于Sigma公司，鼠抗人單克隆Gas2抗體(識別N端)和兔抗人單克隆Gas2抗體(識別C端)均購于Abcam公司。甲基纖維素購于 StemCell Technologies公司。Calpain活性檢測試劑盒購于Biovision公司。β-半乳糖苷酶染色法檢測試劑盒購于碧云天公司。

1.1.3 主要儀器 流式細胞分析及分選儀(Becton Dickinson，美國)，高速離心機(Beckman Coulter，美國)，紫外凝膠成像儀(Bio-Rad，美國)，自動沖片機(Kodak，德國)，垂直電泳儀和轉(zhuǎn)印電泳儀(天能，中國)，PCR 儀(Biometra，德國)，多功能讀板機(Molecular Devices，中國)，智能圖像導航儀(Olympus，日本)，倒置顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 實驗方法

1.2.1 Gas2基因及其變體的克隆 利用PCR的方法分別擴增Gas2的編碼區(qū)及兩種Gas2變體(Gas2Δ171-313和Gas2Δ1-170);上下游引物中引入BamHⅠ識別序列，便于克隆入慢病毒表達載體。

1.2.2 慢病毒的制備 將慢病毒表達載體與ΔR、VSV-G、Rev 3種包裝質(zhì)粒通過磷酸鈣沉淀方式共轉(zhuǎn)染293T細胞，收集轉(zhuǎn)染后48和72 h的培養(yǎng)上清，過濾分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆茫?6］。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法檢測過表達的蛋白 收集4×106YFP+細胞，PBS清洗2次，加入蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4℃14 000×g離心20 min，收集上清并蛋白定量。蛋白樣本加入5×SDS加樣緩沖液，100℃煮沸5 min，進行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，2%脫脂牛奶稀釋一抗4℃孵育過夜，1×TBST洗膜5次，5 min·次-1，加入辣根過氧化物標記的二抗，室溫孵育1 h，最后用ECL顯影［17］。

1.2.4 細胞增殖和集落生成實驗 細胞增殖實驗:24孔板中每孔種植2×104YFP+細胞，培養(yǎng)的第3天和第6天分別進行細胞計數(shù)。集落生成(colony-forming cell，CFC)實驗:在有雙抗和IMDM培養(yǎng)基的甲基纖維素中加入300個YFP+細胞，混勻后接種到直徑為3.5 cm小皿中，37 ℃培養(yǎng)，2 周后計數(shù)［16］。

1.2.5 檢測Calpain活性 收集2×106YFP+細胞，PBS清洗2次，加入100 μl裂解液，冰上裂解20 min，10 000×g離心1 min，收集上清并進行蛋白定量。取50 μg 蛋白，加入 10 μl反應緩沖液，5 μl Calpain 底物，并加入一定量緩沖液至總體積100 μl。37℃避光反應1 h。多功能讀板機上檢測400 nm和505 nm波長處吸光度值。

其工作原理是：通過旋轉(zhuǎn)盤根壓蓋來擠壓銅壓套，銅壓套壓緊盤根，盤根在密封函內(nèi)彈簧的作用下被縱向擠壓發(fā)生橫向膨脹，從而密封柱塞與密封函的環(huán)形空間，防止高壓水刺漏及空氣進入工作腔。

1.2.6 細胞周期分析 取1×106YFP+細胞，70%乙醇固定過夜，加入 RNase A(100 μg·ml-1)，37 ℃避光孵育30 min，再加入碘化丙啶(40 μg·ml-1)，4℃ 避光孵育30 min后流式細胞儀檢測［18］。數(shù)據(jù)使用Flow Jo軟件進行分析。

1.2.7 β-半乳糖苷酶染色法檢測細胞衰老 離心并收集細胞沉淀至1.5 ml離心管內(nèi)，1×PBS洗1次，加1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min。離心，吸取固定液，1×PBS洗3次。離心，棄PBS，加1 ml染色工作液，37℃孵育過夜。取染色后的細胞，觀察并計數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學處理

所有實驗均重復3次以上，數(shù)據(jù)采用Graph Pad Prism 5.0處理。結果以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 載體構建

我們構建了分別表達 Venus、Gas2、Gas2Δ171-313、Gas2Δ1-170的各類慢病毒載體，目的基因由SFFV(spleen focus forming virus)啟動子驅(qū)動(圖1A)。基因序列由DNA測序驗證，Gas2及其變體均能在K562細胞中成功表達(圖1B)。

圖1 載體構建A.schematic structure of lentiviral vector;B.Western blotting to detect the protein expressionFig 1 Vector construction

2.2 Gas2Δ171-313抑制K562細胞的增殖

為了測定Gas2及其變體對K562細胞生長的影響，對照表達Gas2及其變體的細胞在體外培養(yǎng)6 d，并在第3天和第6天分別進行細胞計數(shù)。如圖2所示:表達 Gas2和 Gas2Δ1-170的 K562細胞與對照Venus組相比，生長無顯著差異;而表達 Gas2Δ171-313的K562細胞與對照組相比，細胞生長受到顯著抑制。

圖2 Gas2不同變體對K562細胞增殖能力的影響Fig 2 The effect of different Gas2 mutants on K562 cell proliferation

2.3 Gas2Δ171-313抑制K562細胞的集落生成

為了測定Gas2及其變體對K562體外集落形成能力的影響。我們觀察培養(yǎng)14 d后的集落，Gas2和Gas2Δ1-170形成的集落數(shù)目與對照Venus組無顯著差異，而Gas2Δ171-313組形成的集落數(shù)目較對照組顯著減少(圖3)。

圖3 Gas2不同變體對K562細胞集落生成能力的影響Fig 3 The effect of different Gas2 mutants on colony-forming assay on K562

2.4 Gas2Δ171-313增加Calpain活性

已有研究表明，Gas2Δ171-314通過與 Gas2和Calpastatin競爭性抑制Calpain，從而解除Gas2和內(nèi)源性抑制劑 calpastatin對 Calpain的抑制作用，提高Calpain活性，從而抑制細胞的增殖［14］。我們分別提取對照組和全長及變體Gas2表達細胞的蛋白樣本，并進行Calpain活性的檢測。結果顯示，全長Gas2、Gas2Δ1-170與對照Venus組中Calpain活性無顯著差異;而Gas2Δ171-313與對照組相比，其Calpain活性顯著提高(圖4)。

圖4 Gas2及不同變體對Calpain活性影響Fig 4 The impact of different Gas2 mutants on the calpain activity

2.5 Gas2Δ171-313不影響K562細胞周期和凋亡

為研究Gas2Δ171-313通過何種機制抑制K562細胞的生長，我們首先進行了細胞周期和凋亡的檢測，結果如圖5所示。Gas2、Gas2Δ1-170組與對照Venus組相比，細胞周期的分布沒有發(fā)生顯著變化;Gas2Δ171-313有阻滯細胞在S和G2/M期的趨勢，但其作用并不顯著(P＞0.05)。Gas2及其變體作用后也沒有顯著增多的亞G0/G1期細胞，表明Gas2Δ171-313抑制細胞生長也不是通過誘發(fā)細胞凋亡產(chǎn)生的。

2.6 Gas2Δ171-313誘導K562細胞衰老

為了進一步探索Gas2Δ171-313抑制K562細胞生長的機制，我們進行了β-半乳糖苷酶染色。結果顯示，與對照Venus組相比，Gas2Δ171-313組陽性細胞比例明顯增多，達到(75.27±0.03)%;而 Gas2和Gas2Δ1-170組與對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，分別為(17.41±0.02)%、(14.01±0.02)%和(9.95±0.03)%。見圖6。結果提示，Gas2Δ171-313可能通過促進K562細胞衰老而抑制增殖。

圖6 Gas2及不同變體對K562細胞衰老影響Fig 6 The impact of different Gas2 mutants on the senescence on K562

2.7 Gas2Δ171-313與Imatinib協(xié)同抑制K562細胞集落生成

為研究Gas2Δ171-313能否與IM協(xié)同性地抑制K562生長。我們在IM存在或不存在的條件下進行了集落生成實驗。如圖7所示，當加入IM(1 μmol·L-1和5 μmol·L-1)后，Gas2Δ171-313 組相對于未加入IM細胞的集落存活能力［分別為(4.65±2.41)%和未檢出］較對照Venus組［分別為(40.16±3.73)%和(0.49±0.29)%］有顯著下降，表明Gas2Δ171-313可以與IM協(xié)同性地抑制K562細胞的生長。

圖7 IM與Gas2Δ171-313對K562細胞集落存活的影響Fig 7 Effect of IM and Gas2Δ171-313 on the survival of K562 colonies

3 討 論

Gas2在CML患者中較正常供體高表達［9-12］，然而其生物學意義卻并不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)，僅Gas2Δ171-313對K562細胞生長產(chǎn)生明顯的抑制作用，而全長Gas2和Gas2Δ1-170相比對照組對K562細胞生長影響沒有明顯差異。Gas2Δ171-313對細胞生長的抑制與其增強Calpain的活性相關;Gas2Δ1-170并不能抑制K562細胞的生長，表明在K562中Gas2并不與微管系統(tǒng)結合而阻滯細胞周期進程;全長Gas2既不影響細胞的增殖也不抑制Calpain，我們推測細胞內(nèi)的內(nèi)源性抑制劑已經(jīng)飽和地結合了Calpain并有效地抑制了Calpain的活性，因而過表達Gas2不再顯現(xiàn)出抑制作用。因此，我們認為，Gas2在CML細胞中主要通過結合并抑制Calpain發(fā)揮其生物學功能，而并不通過結合微管阻滯細胞周期進程，這為理解Gas2在CML中異常表達的生物學意義提供了有益的實驗證據(jù)。

通過細胞周期分析，我們發(fā)現(xiàn)，與對照Venus組細胞相比過表達Gas2和它的兩個變體并不能顯著地影響細胞周期的分布;而Gas2Δ171-313也沒有顯著地誘發(fā)細胞凋亡，說明Gas2Δ171-313也不通過誘導凋亡而抑制細胞增殖。

β-半乳糖苷酶活性增強是細胞衰老的典型分子標志。我們發(fā)現(xiàn)，Gas2Δ171-313明顯增強K562細胞的β-半乳糖苷酶活性，而全長Gas2和Gas2Δ1-170并不能顯著改變其活性，提示Gas2Δ171-313可能通過誘發(fā)K562細胞衰老而抑制其增殖。在未來的研究中Gas2Δ171-313如何促進K562細胞衰老值得關注。

在發(fā)現(xiàn)Gas2Δ171-313能抑制K562細胞的生長后，我們也研究Gas2Δ171-313能否與酪氨酸激酶抑制劑IM協(xié)同性地抑制K562。結果顯示，Gas2Δ171-313能夠與IM協(xié)同抑制K562的集落生成能力，提高K562細胞對IM的反應敏感性。這有望為更有效地治療CML提供新思路。

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