胡一珉，濮韻秋，張文懿，和琳，吳建茹，還錫萍，徐金水，王蓓

(1.東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇南京 210009;2.江蘇省疾病預(yù)防控制中心，江蘇 南京 210009)

艾滋病(acquired immune deficiency syndrome，AIDS)是艾滋病病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵犯人的免疫系統(tǒng)，造成以免疫功能下降和各種感染為主要特征的一組綜合征［1］。其機(jī)會(huì)性感染的病原體種類繁多，可侵犯呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)。生殖支原體(mycoplasma genitalium，Mg)、發(fā)酵支原體(mycoplasma fermentans，Mf)和梨支原體(mycoplasma pirum，Mpi)自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，一直被認(rèn)為是艾滋病病程進(jìn)展的協(xié)同因子，稱為“艾滋相關(guān)支原體”。作者以江蘇省部分男性HIV-1感染者為研究對(duì)象，檢測(cè)其艾滋病相關(guān)支原體感染狀況，探索支原體的感染在自然病程中對(duì)不同序列特征患者免疫功能的影響。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

以江蘇省疾病預(yù)防控制中心確認(rèn)的100例男性HIV-1感染者為研究對(duì)象，由調(diào)查對(duì)象自己填寫調(diào)查表，調(diào)查員僅負(fù)責(zé)解釋說(shuō)明。文盲或年幼患者由調(diào)查員詢問(wèn)研究對(duì)象或其父母，代為填寫。采用國(guó)家統(tǒng)一的問(wèn)卷進(jìn)行調(diào)查，主要內(nèi)容包括:出生年月、民族、住址、婚姻狀況、職業(yè)、文化程度、感染途徑等。

1.2 標(biāo)本采集

采集首段尿(first void urine，F(xiàn)VU)用于支原體檢測(cè)。用尿杯按要求收集與上次排尿間隔2 h以上的首段尿10～20 ml，轉(zhuǎn)入尿液標(biāo)本保存管，常溫保存。編號(hào)登記(包括地區(qū)、姓名等信息)后，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)Mg、Mf和 Mpi。

采集患者全血5～6 ml于EDTA-K3抗凝管，并于4 h內(nèi)送至江蘇省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室，用于CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)，隨后離心分離血漿，進(jìn)行IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α 及 IFN-γ 細(xì)胞因子檢測(cè)及 HIV RNA提取。

1.3 支原體檢測(cè)

1.3.1 標(biāo)本處理及試劑準(zhǔn)備 將送回實(shí)驗(yàn)室的尿液標(biāo)本置入離心管中，3 500 r·min-1離心15 min，棄去上層尿液。用1 ml生理鹽水溶解沉淀，吹打混勻，用于 PCR 檢測(cè) Mg、Mf和Mpi。

裂解液配制:KCl溶液(1 mol·L-1)5.0 ml，MgCl2溶液(1 mol·L-1)0.25 ml，Tris-HCl緩沖液(1 mol·L-1，pH 8.0)1.5 ml，20%Tween-20 2.5 ml，用雙蒸水定容至100 ml。用前裂解液與蛋白酶 K(200 μg·ml-1)以50∶2的體積混合。

1.3.2 Mg、Mf和Mpi的檢測(cè) (1)將-20℃冰箱保存的標(biāo)本取出解凍，振蕩混勻標(biāo)本，吸取400 μl置于0.5 ml離心管內(nèi)，15 000r·min-1離心 5 min，吸棄上清液。加裂解液30 μl，振蕩混勻后置入55℃水浴1 h，再置入95℃保溫5 min。10 000 r·min-1離心1 min，上清液即為PCR擴(kuò)增用模版液。在提取模板及PCR反應(yīng)過(guò)程中需設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

3種支原體的特異性DNA片段引物序列見(jiàn)表1。

表1 Mg、Mf和Mpi的特異性DNA片段引物Tab 1 The specific primers for Mg，Mf and Mpi detection

Mg、Mpi的檢測(cè)采用套式PCR方法，第1次PCR反應(yīng)體系為:正、反向引物各 0.5 μl，dNTP(10 mmol·L-1)0.4 μl，10 × PCR Buffer 2 μl，MgCl2(25 mmol·L-1)1.2 μl，Taq 酶(5 U·μl-1)0.3 μl，模板 5 μl，加雙蒸水至總體系20 μl;第2次PCR反應(yīng)體系為:正、反向引物各 1.25 μl，dNTP(10 mmol·L-1)1.0 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，MgCl2(25 mmol·L-1)3 μl，Taq酶(5 U·μl-1)0.5 μl，模板(第 1 次擴(kuò)增產(chǎn)物)1 μl，加雙蒸水至總體系50 μl。Mf采用普通PCR方法檢測(cè)，反應(yīng)體系為:正、反向引物各 1.25 μl，dNTP(10 mmol·L-1)1.0 μl，10 × PCR Buffer 5 μl，MgCl2(25 mmol·L-1)4 μl，Taq 酶(5 U·μl-1)0.5 μl，模板 5 μl，加雙蒸水至總體系 50 μl。

PCR擴(kuò)增條件:Mg、Mpi的兩次PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)均為94℃預(yù)變性2 min，然后按94℃30 s→55℃30 s→72℃40 s共循環(huán)40個(gè)周期，最后1個(gè)循環(huán)72℃延長(zhǎng)至5 min。Mf PCR擴(kuò)增熱循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性2 min，然后按94℃30 s→55℃30 s→72℃30 s共循環(huán)40個(gè)周期，最后1個(gè)循環(huán)72℃延長(zhǎng)5 min。

電壓80 V、40 min，在全自動(dòng)電泳成像分析儀中觀察電泳結(jié)果。

1.4 CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)

TruCOUNT絕對(duì)計(jì)數(shù)管中準(zhǔn)確加入20 μl MultiTEST四色試劑和50 μl全血，充分混勻，室溫陰暗處放置15 min;加入450 μl FACS溶血液，充分混勻，室溫陰暗處放置30 min;向另外3個(gè)TruCOUNT絕對(duì)計(jì)數(shù)管中分別加入50 μl TruCOUNT Control Beads(low/medium/high)作為絕對(duì)計(jì)數(shù)質(zhì)控;運(yùn)行MultiSET程序上機(jī)檢測(cè)。

1.5 細(xì)胞因子檢測(cè)

采用eBioscience公司ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有檢測(cè)及調(diào)查結(jié)果均錄入Excel數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)審核后導(dǎo)入SPSS 11.5形成分析數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。分類資料用頻數(shù)和百分比進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，用卡方檢驗(yàn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HIV/AIDS患者的基本情況

100例病例收集范圍涉及蘇北、蘇南、蘇中地區(qū)，其中蘇南40例，蘇中38例，蘇北地區(qū)22例。年齡18～70歲，平均(36.7±10.1)歲。感染途徑包括異性傳播、同性傳播、注射毒品及輸血/血制品傳播，以性傳播途徑居多。大多數(shù)為江蘇省本地人口，占87.7%。

2.2 HIV/AIDS患者支原體檢出情況

檢測(cè)結(jié)果顯示，3種艾滋病相關(guān)支原體Mg、Mf、Mpi的感染率分別為22.0%、7.0%、23.0%。100例男性HIV/AIDS患者中由性傳播途徑感染者占74.0%，性傳播途徑感染HIV者與其他途徑感染者之間的各種支原體感染率的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過(guò)性傳播途徑感染HIV的患者又可分為通過(guò)異性性行為感染HIV以及通過(guò)同性性行為感染HIV兩種人群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Mf的感染情況在這兩種人群之間存在顯著性差異(χ2Mf=4.381，P=0.036)，通過(guò)同性性行為感染HIV者中Mf的感染率高于異性性行為感染HIV者，詳見(jiàn)表2。

表2 HIV/AIDS患者中不同傳播來(lái)源人群之間支原體感染情況 例Tab 2 The prevalence of Mycoplasmas among patients infected through different ways cases

AIDS患者的Mg和Mpi感染率有高于HIV感染者的趨勢(shì)，由于樣本例數(shù)較少，差異尚無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表3。

表3 HIV/AIDS患者之間支原體感染情況 例Tab 3 The prevalence of Mycoplasmas between HIV infected and AIDS patients cases

2.3 支原體感染與CD4+T細(xì)胞水平的關(guān)聯(lián)性

因目前HIV/AIDS患者的治療指南為“CD4計(jì)數(shù)500以上不建議治療”，所以將患者分為兩組，比較其支原體感染在不同CD4+T細(xì)胞分組時(shí)的情況。未發(fā)現(xiàn)支原體感染與其CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)有關(guān)聯(lián)，詳見(jiàn)表4。

表4 致病性支原體感染與CD4+T細(xì)胞水平的關(guān)聯(lián)性例Tab 4 The relevance of Mycoplasmas infection and CD4+T cells count

2.4 HIV/AIDS患者Th1/Th2細(xì)胞因子變化

感染了艾滋病相關(guān)支原體的男性HIV/AIDS患者外周血IL-4水平明顯高于未感染艾滋病相關(guān)支原體的男性HIV/AIDS患者(WIL-4=6 272.0，P=0.015)，而TNF-α水平明顯低于未感染艾滋病相關(guān)支原體的男性 HIV/AIDS 患者(WTNF-α=84 005.5，P=0.016)，其他因子差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)表5。

表5 艾滋病相關(guān)支原體與男性HIV+/AIDS患者細(xì)胞因子水平比較 pg·ml－1Tab 5 The cytokine levels between AIDS-associated Mycoplasmas infected patients and non-infected patients pg·ml－1

3 討 論

早期感染HIV后，有一段很長(zhǎng)的無(wú)癥狀潛伏期，在此期間，任何一種傳染性病原體通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)都可能在病程中起到某種作用，作為一種機(jī)會(huì)性感染因子，支原體也可能通過(guò)此途徑起作用［2］。支原體感染一般是慢性的，可引起特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。支原體感染的持續(xù)存在可能與兩種機(jī)制有關(guān):一是支原體表面抗原變異，二是支原體對(duì)宿主的分子擬態(tài)，二者均可使其出現(xiàn)免疫逃逸［3］。本研究從流行病學(xué)的角度探討了艾滋病相關(guān)支原體在100例江蘇省男性HIV/AIDS中的感染特征，提示支原體在HIV感染及艾滋病中不能忽視。

免疫平衡是維持機(jī)體自穩(wěn)的重要保障［4］。CD4+T淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)是判斷HIV感染者疾病進(jìn)展的最可靠指標(biāo)［5］。當(dāng)CD4+T淋巴細(xì)胞減少到一定程度時(shí)，免疫系統(tǒng)遭到徹底破壞，免疫功能極度低下，臨床上常見(jiàn)的機(jī)會(huì)性感染發(fā)生，病程即已進(jìn)入AIDS期［6］。每個(gè)HIV感染者的潛伏期長(zhǎng)短不同，這與HIV感染者的年齡、性別、體質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)及種族都有一定關(guān)系，但是這種差別的實(shí)質(zhì)主要是由于CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)減少的速度不同。因此，CD4+T淋巴細(xì)胞被公認(rèn)是HIV感染后評(píng)判其疾病進(jìn)展的最好指標(biāo)［7］。隨著艾滋病病情的加重，除CD4+T細(xì)胞的數(shù)量顯著減少外，同時(shí)存在Th1/Th2細(xì)胞因子的失衡。在正常人體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子保持著動(dòng)態(tài)平衡［8］，如果這一平衡發(fā)生漂移，就會(huì)導(dǎo)致疾病的發(fā)生［9-10］。當(dāng)Th1狀態(tài)占優(yōu)勢(shì)時(shí)，細(xì)胞免疫增強(qiáng)，抗病毒能力較強(qiáng)，而當(dāng)Th2狀態(tài)占優(yōu)勢(shì)時(shí)，對(duì)HIV的易感性將大大增強(qiáng)，導(dǎo)致病情的進(jìn)一步發(fā)展［11］。感染了艾滋病相關(guān)支原體的男性HIV/AIDS患者外周血IL-4、TNF-α的表達(dá)水平明顯低于未感染艾滋病相關(guān)支原體的男性HIV/AIDS患者，提示艾滋病相關(guān)支原體與HIV共感染的狀態(tài)會(huì)對(duì)Th1/Th2型細(xì)胞因子的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定產(chǎn)生影響。

本次研究雖然樣本例數(shù)較少，尚不能得出肯定的結(jié)論，但初步的分析結(jié)果給今后研究提供了依據(jù)，提示進(jìn)一步探索支原體感染在HIV自然病程中的對(duì)其免疫功能的影響及機(jī)制具有重要意義，同時(shí)也需要對(duì)更多的HIV感染者和AIDS患者進(jìn)行更長(zhǎng)期的隨訪追蹤調(diào)查才能得到較為肯定的結(jié)論。

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