張蕊蕊，胡偉群，朱衛(wèi)剛，陳 杰，李建高

(1.國(guó)家南方農(nóng)藥創(chuàng)制中心浙江基地 浙江省化工研究院，浙江杭州 310023;2.南通泰禾化工有限公司，江蘇 南通 226000)

玉米起源于美洲，作為糧食種植于中美洲、南北美洲已經(jīng)有上千年的歷史。玉米銹病在世界種植區(qū)內(nèi)均有發(fā)生［1］，主要包括普通玉米銹病 (Puccinia sorghi Schw)，南方玉米銹病 (Puccinia．polysora Underw)和熱帶玉米銹病 (Physopella zeae(Mains)Cumm.and Ramochar)3種。其中，普通玉米銹病主要在中國(guó)黃淮海以及新疆玉米種植區(qū)發(fā)生［2-3］，南方玉米銹病主要發(fā)生在中國(guó)南方地區(qū)［4］，熱帶玉米銹病在中國(guó)海南以及臺(tái)灣地區(qū)時(shí)有發(fā)生［5］。

目前防治玉米銹病的方法主要通過(guò)種植抗病品種及適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)防治。生產(chǎn)上常使用三唑類和有機(jī)硫類殺菌劑對(duì)之進(jìn)行防治。植物病害防治的另一種重要途徑是利用生物或者非生物的植物誘導(dǎo)抗病激活劑，通過(guò)激活植物體自身的免疫系統(tǒng)來(lái)抵抗植物病害的侵襲。植物抗病激活劑自身沒(méi)有殺菌活性，但可誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。植物抗病激活劑具有廣譜性且不誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗藥性。迄今為止，已經(jīng)商品化的植物抗病激活劑有活化酯(BTH)、烯丙苯噻唑、有效霉素A和tiadinil等［6］。

氟唑活化酯是由華東理工大學(xué)創(chuàng)制開發(fā)的新型化合物，屬于植物抗病激活類誘導(dǎo)劑［7］。此類活化酯衍生物可用于誘導(dǎo)植物次級(jí)代謝產(chǎn)物紫杉類化合物;同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)該類化合物可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性反應(yīng)，包括促進(jìn)活性氧迸發(fā)以及激活苯丙氨酸解氨酶 (PAL)等［8］。通過(guò)研究施藥次數(shù)、施藥濃度及接種天數(shù)對(duì)氟唑活化酯防治玉米銹病的影響，并對(duì)其誘導(dǎo)的生理機(jī)制進(jìn)行了初步探索，以期為氟唑活化酯的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試藥劑為5%氟唑活化酯乳油，上海泰禾化工有限公司提供;供試菌種為普通玉米銹病Puccinia sorghi Schw，浙化院生測(cè)安評(píng)中心活體繼代培養(yǎng);供試植物為玉米品種農(nóng)大108。

1.2 方法

1.2.1 不同處理對(duì)誘導(dǎo)玉米銹病生物活性的影響

將供試藥劑配制成 6.25，12.50，25.00，50.00 mg·L-1濃度的藥液備用，以清水處理為空白對(duì)照，設(shè)2次用藥與1次用藥2個(gè)處理，重復(fù)3次。

2次用藥是在植株2葉1心期施藥1次，采用葉面噴霧施藥，將供試藥劑均勻噴施到苗齡一致的植株葉面，以噴濕不滴水為宜。每隔5 d噴霧1次，共施藥2次。分別于第2次藥后3，5，7，9 d噴霧接種孢子濃度為10萬(wàn)個(gè)·mL-1左右的玉米銹病孢子懸浮液。接種后的試材自然風(fēng)干，然后移至人工氣候室 (25℃，相對(duì)濕度70%)，8 d后視空白對(duì)照發(fā)病情況進(jìn)行分級(jí)調(diào)查，按病指計(jì)算防效。

1次用藥時(shí)只施1次藥，時(shí)間與2次用藥時(shí)的第1次施藥同時(shí)進(jìn)行，分別于施藥后3，5，7，9 d接種玉米銹病。接種后的試材自然風(fēng)干，然后移至人工氣候室，8 d后視空白對(duì)照發(fā)病情況進(jìn)行分級(jí)調(diào)查，按病指計(jì)算防效。

參照李復(fù)寧［9］對(duì)小麥條銹病嚴(yán)重度的研究，將玉米銹病分為以下6級(jí):0級(jí)，無(wú)病癥;1級(jí)，葉片整個(gè)發(fā)病面積5%及以下;2級(jí)，葉片整個(gè)發(fā)病面積達(dá)10% ～20%;3級(jí)，葉片整個(gè)發(fā)病面積達(dá)30%～40%;4級(jí)，葉片整個(gè)發(fā)病面積達(dá)50%～60%及以下;5級(jí)，葉片整個(gè)發(fā)病面積達(dá)80%～100%，葉片枯死。

1.2.2 氟唑活化酯誘導(dǎo)植株體內(nèi)POD和PAL活性

用50.00 mg·L-1氟唑活化酯處理2葉1心期玉米植株，于噴藥后3，5，7，9，14 d測(cè)定植株體內(nèi)POD、PAL活性，以未噴施的植株為空白對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.3 酶活測(cè)定

PAL的提取及測(cè)定參照薛應(yīng)龍［10］的方法稍加改進(jìn):稱取4 g葉片，冰浴后加10 mL含有5 mmol·L-1β-巰基乙醇的pH值 8.8的硼酸鹽緩沖液、0.5 g聚乙烯吡咯烷酮及少量石英砂研磨勻漿。在4℃條件下，10 000 g離心15 min，上清液用于PAL的測(cè)定。酶液反應(yīng)體系為:0.1 mL PAL提取液，3.9 mL 0.05 mol·L-1pH值8.8的硼酸緩沖液，1 mL 0.02 mol·L-1苯丙氨酸，40℃保溫1 h，而后用0.2 mL的6 mol·L-1HCl終止反應(yīng)。測(cè)光密度值D290，以未經(jīng)誘導(dǎo)的植株為對(duì)照。

POD的提取及測(cè)定參照李合生［11］的方法稍加改進(jìn):稱取 4 g葉片，冰浴后加 15mL 0.05 mol·L-1pH值8.8的磷酸緩沖液和少量石英砂研磨勻漿。在4℃條件下，10 000 g離心15 min，上清液用于POD的測(cè)定。用愈創(chuàng)木酚和H2O2比色法測(cè)定，依次加以下反應(yīng)液:2.91 mL的0.05 mmol·L-1磷酸緩沖液 (pH 值8.8)，1 mL的0.05 mol·L-1愈創(chuàng)木酚，0.1 mL上述酶液，1 mL的 2%H2O2，34℃保溫3 min，迅速稀釋1倍，測(cè)定測(cè)光密度D470，每隔1 min記錄1次，共記錄5次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

百分比數(shù)據(jù)先進(jìn)行反正弦平方根轉(zhuǎn)換，應(yīng)用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行三因素方差分析，采用LSD法進(jìn)行多重比較［12］。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)植株病情指數(shù)和防效的影響

通過(guò)表1可以看出，隨著藥劑濃度的增加，病情指數(shù)有降低的趨勢(shì)。在1～2次用藥情況下，藥后5 d接種的病情指數(shù)要低于藥后3 d接種的病情指數(shù)。藥后7 d接種的病情指數(shù)稍高于藥后5 d接種的病情指數(shù)。1次藥后3 d接種的病情指數(shù)略微高于2次藥后3 d接種的病情指數(shù)，前者對(duì)玉米銹病的防效略微低于2次用藥后的藥劑防效。上述結(jié)果可知，隨著藥劑濃度增加，病情指數(shù)顯著降低，藥劑防效顯著升高;隨著用藥次數(shù)增加，防效有所增加，但是1次與2次施藥處理間沒(méi)有顯著性差異。

通過(guò)三因素互作方差分析表2可以看出，藥劑濃度及接種天數(shù)對(duì)病情指數(shù)及藥劑防效的影響均達(dá)到了顯著水平。施藥次數(shù)及接種天數(shù)的互作對(duì)病情指數(shù)及藥劑防效的影響也達(dá)到了顯著水平。施藥次數(shù)對(duì)病情指數(shù)及藥劑防效的影響不顯著。

2.2 氟唑活化酯對(duì)植株體內(nèi)酶活性的誘導(dǎo)

由圖1可知，當(dāng)施用氟唑活化酯5 d之后，植株體內(nèi)的POD活性顯著升高，與未施用的活性差異顯著。施用7 d之后，植株體內(nèi)POD活性有了極顯著升高。施用9 d之后，植株體內(nèi)POD活性下降，且與未施用的植株之間沒(méi)有顯著性差異。施用14 d之后，植株體內(nèi)POD活性下降，且與未經(jīng)施用的植株之間沒(méi)有顯著性的差異。

由圖2可知，與未經(jīng)施用氟唑活化酯的植株相比，施用之后5～14 d的植株體內(nèi)的PAL活性都有了顯著性升高。

表2 三因素互作方差分析

圖1 氟唑活化酯處理對(duì)植株體內(nèi)POD活性的影響

施用5 d之后，植株體內(nèi)的PAL活性有了極顯著的升高;施用7 d之后植株體內(nèi)的PAL活性有所下降，但與未施用的植株的差異達(dá)到極顯著水平;施用9 d之后，植株體內(nèi)PAL活性下降，但與未施用的植株之間差異極顯著。14 d之后PAL酶活有略微的上升，與對(duì)照之間差異顯著。

圖2 氟唑活化酯處理后植株體內(nèi)PAL活性變化

3 小結(jié)與討論

Sharma等［13］研究表明，植株病情指數(shù)會(huì)隨著施用BTH次數(shù)的升高而降低。本研究表明，施藥次數(shù)對(duì)植株病情指數(shù)的影響不明顯，可能是由于試驗(yàn)作物不一。前者試驗(yàn)中的作物為雙子葉植物豆類，本試驗(yàn)中供試作物為單子葉植物玉米。與前者進(jìn)行的田間試驗(yàn)不同，本試驗(yàn)在可控溫控濕的人工氣候室中進(jìn)行。田間與室內(nèi)試驗(yàn)條件的差異可能導(dǎo)致了最終試驗(yàn)結(jié)果的差異。

本研究表明，施藥濃度對(duì)病情指數(shù)的影響達(dá)到了顯著水平。隨著施藥濃度的升高，植株病情降低。但在黃瓜上的預(yù)試驗(yàn)表明，在100 mg·L-1條件下，氟唑活化酯對(duì)黃瓜植株產(chǎn)生輕微要害，當(dāng)濃度達(dá)到200 mg·L-1時(shí)，對(duì)黃瓜植株產(chǎn)生葉片焦枯、皺縮等嚴(yán)重藥害癥狀。因此在氟唑活化酯施用時(shí)，選擇合適的濃度是必要的。

接種天數(shù)對(duì)病情指數(shù)的影響也達(dá)到了顯著水平。研究表明，施用抗病激活劑類藥劑之后，單子葉植物可以獲得終身獲得抗性［14-15］。李喜娥等［16］研究發(fā)現(xiàn)，BTH類抗病激活劑能夠影響植株葉片的光合作用特性，能夠提高植株葉片的凈光合速率、葉綠素含量等并能夠降低葉片受侵染后產(chǎn)生的光合作用下降等癥狀。因此在植株發(fā)病前較早施用氟唑活化酯，使植株可能較早獲得終身抗性，配合抗病品種的種植，可增強(qiáng)植株抵抗病蟲害的能力。

李玉紅等［17］研究表明，BTH類抗病激活劑能夠顯著誘導(dǎo)植株發(fā)病前期引起植株體內(nèi)H2O2的積累，且能夠增加植株發(fā)病后期消除過(guò)量H2O2的能力。Xu等［8］研究發(fā)現(xiàn)，BTH衍生物可以誘導(dǎo)植株產(chǎn)生抗病反應(yīng)，能夠促進(jìn)植物體內(nèi)的活性氧的迸發(fā)以及激活苯丙氨酸解氨酶。本研究表明，植株施用氟唑活化酯3～5 d之后，其體內(nèi)的 POD、PAL活性有了極大的提高，與對(duì)照相比達(dá)到了顯著水平。一般來(lái)說(shuō)，2次施藥之后植株體內(nèi)2種酶的活性會(huì)再次升高。氟唑活化酯可以誘導(dǎo)植物體內(nèi) POD、PAL活性的升高，是氟唑活化酯的誘導(dǎo)機(jī)制之一。

Sharma等［13］研究結(jié)果還表明，增加施藥次數(shù)能夠顯著增加作物產(chǎn)量;更有研究表明，施用BTH類抗病激活劑能夠提高果實(shí)品質(zhì)和產(chǎn)量［18］。本試驗(yàn)中由于條件限制并未進(jìn)行收獲后的產(chǎn)量評(píng)價(jià)。建議對(duì)于氟唑活化酯這種新化合物繼續(xù)進(jìn)行田試研究。

綜合考慮不同施藥次數(shù)、藥劑濃度及接種天數(shù)對(duì)玉米銹病病情指數(shù)及藥劑防效的影響及施藥之后植株體內(nèi)相關(guān)酶活的變化，氟唑活化酯在藥后5 d出現(xiàn)誘導(dǎo)抗性高峰，且隨著用藥次數(shù)增加，防效有所升高。結(jié)合田間農(nóng)民用藥習(xí)慣，建議氟唑活化酯施藥方式為施藥2次，間隔5 d。在病害發(fā)生前期施用，結(jié)合抗病品種的種植，培育無(wú)病壯苗，對(duì)病害進(jìn)行預(yù)防性控制是關(guān)鍵。

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