李淼　張曉敏　司慶宗

[摘要] 目的 分析3種假絲酵母菌的磁共振代謝物圖譜，探討用代謝組學(xué)方法快速鑒定口腔黏膜致病菌的可行性。方法 在沙保培養(yǎng)基中分別接種白色假絲酵母菌ATCC 10231、熱帶假絲酵母菌ATCC 13803和光滑假絲酵母菌ATCC 15126，繪制生長曲線，選擇3種菌生長穩(wěn)定期的培養(yǎng)液檢測其磁共振圖譜，用主成分分析法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果 主成分分析法顯示：每兩種細(xì)菌在主成分得分圖中有組間分散、組內(nèi)聚集的特點(diǎn)，可以區(qū)分不同的假絲酵母菌。結(jié)論 代謝組學(xué)分析技術(shù)是一種有良好發(fā)展前景的口腔細(xì)菌快速鑒定技術(shù)。

[關(guān)鍵詞] 代謝組學(xué)； 磁共振； 假絲酵母菌； 主成分分析

[中圖分類號] R 739.86 [文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.018

白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌是正常人口腔、胃腸道、呼吸道及陰道黏膜的常見共生菌，僅能在特定條件下造成宿主感染。代謝組學(xué)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的一門對生物體或細(xì)胞的所有低相對分子質(zhì)量代謝產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析的新技術(shù)。高分辨率磁共振（nuclear ma-

gnetic resonance，NMR）可用于對細(xì)胞外微量代謝組分進(jìn)行檢測，得到相應(yīng)的代謝圖譜，使用先進(jìn)的軟件分析方法可以正確地歸類處理這些圖譜。本研究對與口腔黏膜病相關(guān)的3種假絲酵母菌的代謝圖譜進(jìn)行比較，用主成分分析法（principal components ana-lysis，PCA）進(jìn)行分析，探討用該方法尋找特征性產(chǎn)物來鑒定假絲酵母菌的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)菌株及實(shí)驗(yàn)儀器

白色假絲酵母菌ATCC 10231、熱帶假絲酵母菌

ATCC 13803、光滑假絲酵母菌ATCC 15126（上海川翔生物科技有限公司）；CH-2生物顯微鏡（Olympus公司，日本），分光光度計(jì)（上海尤尼卡公司），高

速低溫離心機(jī)（Jouan公司，法國），-80 ℃低溫冰箱（Heto Ultra公司，美國），磁共振儀（Bruker公司，德國）；重水（上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司）；分析軟

件SIMCA-P 11.0（Umea公司，瑞典）。

1.2 生長曲線的繪制

將白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌解凍，增菌48 h，經(jīng)顯微鏡形態(tài)學(xué)檢查及科瑪嘉顯色培養(yǎng)基鑒定為純培養(yǎng)后，分別將3種假絲酵母菌接種于沙保培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，用分光光度計(jì)調(diào)整菌懸液吸光度值為1.00±0.05備用。在9支試管中分別加入沙保培養(yǎng)液4.5 mL，在每支試管中加入白色假絲酵母菌菌懸液50 μL，同法將熱帶假絲酵母菌及光滑假絲酵母菌菌懸液50 μL分別加入9支試管中，各試管在37 ℃、200 r·min-1搖床行增菌培養(yǎng)，在3、6、9、12、24、36、48、60、72 h各取1支，旋渦振蕩器混勻30 s，分光光度計(jì)測量菌懸液吸光度值，以純沙保培養(yǎng)液作陰性調(diào)零，測定3種假絲酵母菌的菌懸液密度。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均值，以時(shí)間（h）為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600值為縱坐標(biāo)繪制生長曲線。

1.3 測試樣本的制備

分別取3種假絲酵母菌生長穩(wěn)定期（培養(yǎng)36 h）的培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液1 mL，加0.5 mL磷酸鹽緩沖液（2.4 g·L-1 KH2PO4，

8 g·L-1 Na2HPO4，7.2 g·L-1 NaCl），混勻后靜置10 min，以相同條件（4 ℃、10 000 r·min-1）離心10 min，吸取上清液用0.22 μm濾紙過濾，取1.35 mL濾液，加入重水0.15 mL，混勻后將樣品移入核磁管中（每管1.5 mL），置于-80 ℃低溫冰箱保存，NMR測定前解凍并保持在0 ℃左右。

1.4 1H-NMR圖譜的采集和處理

將核磁管放入磁共振儀中進(jìn)行1H-NMR譜掃描，樣本的掃描溫度設(shè)置為295 K室溫。采用磁共振儀專用參數(shù)，包括采集點(diǎn)數(shù)32×1 024，累加次數(shù)128次，每個(gè)樣本掃描后均收集到131 072個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，波寬為7 788.162 11 Hz，每個(gè)樣本掃描2～3 min，將得到的15個(gè)原始的自由感應(yīng)衰減信號（free induction decay，

FID）輸入MestReC軟件進(jìn)行傅里葉轉(zhuǎn)換（Fourier tran-sition，F(xiàn)T），并進(jìn)行相位調(diào)整和基線調(diào)整，獲得相位滿意、基線平整的1H-NMR圖譜。調(diào)用軟件的積分工具，除去水峰所在區(qū)間，并對1H-NMR譜進(jìn)行分段積分，其中每個(gè)FID信號有200個(gè)積分值。將每個(gè)樣本的積分值導(dǎo)入Excel表中備用。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。用SIMCA-P 11.0軟件對200個(gè)積分值進(jìn)行化學(xué)計(jì)量上的處理，以主成分矢量為坐標(biāo)軸作二維圖，即得分圖，從而對不同的菌懸液進(jìn)行分析，找出類別間的差異所在。

2 結(jié)果

2.1 3種細(xì)菌的生長曲線

3種假絲酵母菌的生長曲線見圖1。由圖1可見，3種菌的生長規(guī)律相似，36～48 h生長繁殖達(dá)到高峰，處于穩(wěn)定期，48 h后處于衰亡期。選擇生長穩(wěn)定期（36 h）的代謝物測1H-NMR圖譜。

2.2 1H-NMR圖譜的測定結(jié)果

圖2為白色假絲酵母菌、熱帶假絲酵母菌和光滑假絲酵母菌的1H-NMR圖譜，3種菌的氫譜輪廓相似，其代謝物集中在化學(xué)位移值為3.5×10-6和1.0×10-6附近，每種菌代謝物集中出現(xiàn)區(qū)域的波譜形態(tài)與強(qiáng)度并不完全一樣，但通過單純的1H-NMR圖譜無法清楚準(zhǔn)確地區(qū)分3種菌。

2.3 PCA結(jié)果

以不同假絲酵母菌代謝物主成分矢量為坐標(biāo)軸做出的PCA得分圖見圖3～5，可見不同數(shù)據(jù)有組間離散、同類數(shù)據(jù)有組內(nèi)聚集的特點(diǎn)。白色假絲酵母菌散點(diǎn)圖內(nèi)部有較好的聚集，與熱帶假絲酵母菌的得分圖沒有混雜（圖3）。白色假絲酵母菌相對于光滑假絲酵母菌的散點(diǎn)圖團(tuán)聚性更好，可以很好地與光滑假絲酵母菌區(qū)分開，且散點(diǎn)圖均位于95%的可信區(qū)間內(nèi)（圖4）。熱帶假絲酵母菌與光滑假絲酵母菌各自

的團(tuán)聚性很好，不同細(xì)菌沒有混雜（圖5）。

3 討論

近年來，隨著廣譜抗生素的濫用，腎上腺皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒性藥物和放射治療的廣泛應(yīng)用，口腔假絲酵母菌性損害日益增多。Shen等[1]在研究中國老

年人根面齲細(xì)菌學(xué)時(shí)指出，白色假絲酵母菌檢出率高達(dá)63.33%。Gbris等[2]認(rèn)為，白色假絲酵母菌是齲病的危險(xiǎn)因素之一，其數(shù)量與齲有很強(qiáng)的相關(guān)性。由此可見，分離和快速鑒定假絲酵母菌有很重要的臨床意義。在假絲酵母菌性損害中，最常見的是白色假絲酵母菌，其毒力最強(qiáng)。近年來光滑假絲酵母菌檢出率也逐漸增高，且對氟康唑等抗真菌藥物并不敏感，需要在臨床中加以區(qū)分，以選擇不同的治療方案。本實(shí)驗(yàn)采用代謝組學(xué)鑒定法對3種假絲酵母菌進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：基于NMR的代謝組學(xué)及一系列化學(xué)計(jì)量學(xué)和多元統(tǒng)計(jì)學(xué)方法可以區(qū)分不同的假絲酵母菌。

近年來，代謝組學(xué)在疾病診斷，植物、微生物研究中均有大量的文獻(xiàn)出現(xiàn)。作為一門研究生物體內(nèi)源性代謝物整體及其變化規(guī)律的學(xué)科，代謝組學(xué)實(shí)際上是分析化學(xué)、化學(xué)計(jì)量學(xué)和生命科學(xué)的交叉學(xué)科。它利用了分析化學(xué)的各種譜學(xué)技術(shù)，包括磁共振波譜、質(zhì)譜、色譜、紅外和拉曼光譜等進(jìn)行研究。本研究的方法是常用的磁共振波譜，通過磁共振波譜獲得海量、多維的數(shù)據(jù)后進(jìn)行正確的分析是本研究的關(guān)鍵步驟。

PCA是最常用的分析方法，是將分散于一組變量上的信息集中于幾個(gè)綜合指標(biāo)上，發(fā)揮了數(shù)據(jù)降維分析的作用，避免淹沒于大量數(shù)據(jù)中[3]。從PCA得分圖可觀察樣品的集聚或離散程度。樣品分布點(diǎn)越靠近，說明這些樣品中所含有的變量和/或分子的組成和濃度越接近；反之，樣品分布點(diǎn)越遠(yuǎn)離，其差異越大；因此，得分圖也可以更形象地稱為樣品分布散點(diǎn)圖。本實(shí)驗(yàn)中，3張散點(diǎn)圖中不同的細(xì)菌無交叉，同一細(xì)菌間有聚集趨勢。在光滑假絲酵母菌與熱帶假絲酵母菌的散點(diǎn)圖中，數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出很好的團(tuán)聚性。PCA也存在一些問題，由于實(shí)驗(yàn)的操作因素或樣本本身的原因經(jīng)常會有離群樣本點(diǎn)存在，這會嚴(yán)重影響聚類結(jié)果[4]和生物標(biāo)志物的尋找結(jié)果。此

外，同一細(xì)菌的不同代謝物可能有較明顯的尺度差異，主成分的選擇會受到濃度較大組分的影響[5]，一

些濃度小的代謝組分的影響通常體現(xiàn)不出來，而這些小濃度組分往往有很重要的生物學(xué)意義。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在同一張散點(diǎn)圖中，光滑假絲酵母菌相對于白色假絲酵母菌的散點(diǎn)圖更加分散。在后續(xù)的研

究中，筆者認(rèn)為，應(yīng)該摸索如何用尺度同一化的方法進(jìn)行數(shù)據(jù)預(yù)處理來消除數(shù)據(jù)的尺度差異。

經(jīng)典的微生物分類方法多根據(jù)微生物形態(tài)學(xué)以及對不同底物的代謝情況進(jìn)行表型分類。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因型分類法得到了廣泛應(yīng)用，但是，某些菌株按照表型與基因型兩種方法分類時(shí)會得出不同的結(jié)果。在這種情況下，代謝譜分析法逐漸成為一種快速、高通量、全面的表型分類方法[6]。該方法可通過檢測細(xì)胞外代謝物進(jìn)行鑒別，與現(xiàn)有其他細(xì)菌鑒定方法相比較，基于NMR的代謝組學(xué)技術(shù)具有樣品處理簡單、用量少（只需10 mg）、測定快

速（只需5 min）、無侵入性、不破壞樣品的結(jié)構(gòu)性質(zhì)

等優(yōu)點(diǎn)，可作為常規(guī)細(xì)菌鑒定分類方法的有益補(bǔ)充。

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（本文編輯 吳愛華）