趙海霞 馬肅 陳力 劉培紅 徐晶 侯琳 陳蕊 秦春林

[摘要] 目的 分析尼古丁對大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量以及堿性磷酸酶（ALP）活性的影響。方法 將20只5周齡健康雄性Wistar大鼠隨機分為實驗組和對照組，實驗組每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，對照組腹腔注射等量生理鹽水，3個月后處死取材。濃酸消化法檢測牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量，改良Reddi法檢測牙槽骨和頜骨內(nèi)ALP活性。采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分別行獨立樣本的t檢驗。結(jié)果 與對照組相比較，實驗組牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量均明顯減少，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；ALP活性無明顯變化（P>0.05）。實驗組中牙槽骨與頜骨比較，骨鈣磷含量和ALP活性差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論 尼古丁下調(diào)大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量，對ALP活性的影響不明顯。

[關(guān)鍵詞] 尼古?。?牙槽骨； 頜骨； 鈣； 磷； 堿性磷酸酶

[中圖分類號] R 781.4 [文獻標志碼] A [doi] 10.7518/hxkq.2013.03.002

流行病學研究顯示：吸煙與牙周炎的普遍性、嚴重性及骨喪失關(guān)系密切；對牙周治療有負面影響，常影響牙周治療的效果。吸煙者牙周炎的臨床體征明顯有別于非吸煙者，如牙周探診出血少、牙周袋深、牙槽骨喪失嚴重等[1-2]。

尼古丁作為煙草中的主要生物堿，能促進機體釋放神經(jīng)傳導物質(zhì)，限制抗體的產(chǎn)生，影響外周免疫調(diào)節(jié)T細胞；減少機體對鈣的吸收從而導致骨質(zhì)疏松，影響成骨和骨的礦化[3]。體外研究[4]發(fā)現(xiàn)尼古丁通過抑制成骨細胞的增殖、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性和Ⅰ型膠原纖維（collagen type Ⅰ，COL1）的分泌從而抑制骨形成及礦化。但關(guān)于

尼古丁對骨形成和改建影響的體內(nèi)研究尚缺乏相關(guān)報道，其機制尚不清楚。

骨形成過程包括成骨細胞增殖、細胞外基質(zhì)成熟、細胞外基質(zhì)礦化和成骨細胞凋亡4個階段。生物礦化則是指細胞合成和分泌有機基質(zhì)后，鈣和磷酸根不斷沉積其中，當達到飽和度時，在基質(zhì)上與非膠原蛋白結(jié)合形成磷酸鈣晶核，晶核長大為晶體，與基質(zhì)一起組成結(jié)構(gòu)有序的礦化組織。礦化組織中的無機物主要是鈣和磷，ALP在礦化組織細胞如成

骨細胞中高表達，是生物礦化的重要標記[5-7]。本實驗擬通過定量檢測腹腔注射尼古丁動物模型不同部位骨內(nèi)的鈣磷含量以及ALP活性的差異，初步探討尼古丁對骨礦化的影響。

1 材料和方法

1.1 藥物、試劑和儀器

尼古丁（北京伊普瑞斯科技有限公司），對硝基苯磷酸二鈉（disodium 4-nitrophenyl phosphate，PNPP）

（Sigma公司，美國），電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（熱電公司，美國），微波消解儀（型號MARS-5，培安公司，美國），電熱恒溫鼓風干燥箱（天津市中環(huán)

實驗電爐有限公司），電子天平（型號AB204-s，梅特

勒公司，瑞士）。

1.2 動物的選擇、分組和建模

選取由哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院實驗動物中心提供的5周齡健康雄性Wistar大鼠20只為研究對象，體重為120～140 g。隨機分為實驗組和對照組，實驗組每天腹腔注射尼古丁0.73 mg·kg-1，對照組腹腔注射等量生理鹽水，常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 取材和組織生物化學檢測

建模3個月后取材。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，在碎冰上解剖大鼠下頜骨后，除凈附著的軟組織，剪除切牙部分，獲取下頜切牙區(qū)牙槽骨，同時剪取下頜支部分，分別用濕紗布包裹后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.1 骨鈣骨磷的測定 自-80 ℃冰箱取出大鼠左側(cè)下頜牙槽骨和頜骨標本分別稱濕重，利用阿基米德原理測定樣本的體積，電熱恒溫箱烘干至恒重后進行以下測定。1）骨干重測定：電子天平稱量，精確到0.000 1 g；2）骨礦物質(zhì)測定：取鈣標準溶液配

制成10、50、100、200、500×10-6的標準系列；取磷標準溶液配制成5、25、50、100、250×10-6的標準系列。每個樣本分別置于消化罐中并加入1 mL去離子水、2 mL 30%過氧化氫、5 mL濃硝酸，同時設(shè)置空白對照，密閉后置微波消解儀中消化2 h，樣本最后定容至25 mL，借用電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀，光譜系為178.2條件下測定骨鈣骨磷含量，求單位體積的骨鈣骨磷含量。

1.3.2 ALP測定 自-80 ℃冰箱取出大鼠右側(cè)下頜牙槽骨和頜骨樣本分別稱濕重，用改良Reddi法[8]，至勻漿機內(nèi)加入冰預冷的生理鹽水2 mL勻漿，10 000 r·min-1離心10 min。取上清液100 μL，加入1 mmol·L-1 PNPP 50 μL，37 ℃孵育15 min，加1 mol·L-1 NaOH 50 μL中止反應(yīng)，在405 nm波長酶標儀下測定光密度（optical density，OD）值，計算單位體積的ALP。

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行分析，對照組和實驗組大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性的數(shù)值行完全隨機分組的獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

對照組大鼠牙槽骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的42%，鈣/磷比值為2.36，ALP活性為1.679；頜骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的41%，鈣/磷比值為2.39，ALP活性為1.170。統(tǒng)計學結(jié)果顯示：牙槽骨內(nèi)鈣磷含量與頜骨內(nèi)鈣磷含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P=

0.079、0.180）；牙槽骨內(nèi)ALP活性與頜骨內(nèi)ALP活性比較有明顯差異（P=0.041）（圖1、2）。

圖 2 尼古丁對大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)ALP活性的影響

Tab 2 The effects of nicotine on the ALP activity in rat alveolar

bone and mandible

實驗組大鼠牙槽骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的40%，鈣/磷比值為2.35，ALP活性為1.545；頜骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的39%，鈣/磷比值為2.41，ALP活性為1.013。統(tǒng)計學結(jié)果顯示：實驗組大鼠牙槽骨

內(nèi)鈣磷含量和ALP活性與頜骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性相比較差異無統(tǒng)計學意義（P=0.500、0.528、0.065）。與對照組大鼠相比較，實驗組大鼠牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量均明顯減少（P=0.010、0.020，P=0.034、0.019），ALP活性無明顯差異（P=0.644、0.380）（圖

1、2）。

3 討論

3.1 動物模型的建立

大鼠因其價廉、易飼養(yǎng)、變量可控性好、骨骼系統(tǒng)的解剖結(jié)構(gòu)和骨代謝與人類極為相似而被用于骨代謝的研究[9]。有學者[10]報告：70 kg體重的成人每天吸20支煙，攝入尼古丁的量約為0.15～0.18 mg·kg-1。根據(jù)藥理實驗方法學[9]提供的人與動物間表面積折

算的等效劑量比值，大鼠與人的比值為56.0，據(jù)此推算200 g大鼠用量約為人用量的1/6，經(jīng)換算，此量相當于1人每天吸15支煙的尼古丁含量。侯秀敏等[11]對6周齡Wistar大鼠（160～180 g）進行被動吸煙2個月，結(jié)果表明煙草煙霧下調(diào)牙槽骨內(nèi)牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1的表達，認為影響牙槽骨礦化。基于大鼠的生理特性，本實驗選擇5周齡Wistar大鼠（120～140 g）為研究對象，腹腔注射尼古?。刻?.73 mg·kg-1）3個月，觀察尼古丁對大鼠牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量以及ALP活性的差異影響。

3.2 正常大鼠牙槽骨內(nèi)和頜骨內(nèi)鈣磷含量、ALP活

性及兩部位間的差異表現(xiàn)

在骨的發(fā)生學上，牙槽骨和頜骨的形成均是膜內(nèi)成骨，在即將成骨的部位由間充質(zhì)細胞分化為成骨細胞[6-7]。成骨細胞通過基質(zhì)小泡釋放鈣離子和ALP等酶類物質(zhì)，鈣離子在ALP作用下沉積在膠原纖維絲上，完成基質(zhì)的礦化過程，最后形成礦化的骨小梁和平行的內(nèi)、外板。骨組織化學成分的含量和結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，但鈣磷含量比例基本一致，骨的鈣/磷比值平均為2.33。在骨的組織結(jié)構(gòu)上，牙槽骨疏松多孔，呈非均質(zhì)性[12]；下頜升支頰側(cè)皮質(zhì)

骨較舌側(cè)厚，松質(zhì)骨于升支中份厚度最大，部分下頜升支無松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)[13]。本實驗結(jié)果顯示：對照組

牙槽骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的42%，鈣/磷比值為2.36，ALP活性為1.679；頜骨內(nèi)鈣磷總含量約占其重量的41%，鈣/磷比值為2.39，ALP活性為1.170。統(tǒng)計學結(jié)果顯示：對照組大鼠牙槽骨內(nèi)鈣磷含量和頜骨內(nèi)鈣磷含量比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），牙槽骨內(nèi)ALP活性與頜骨內(nèi)ALP活性比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。提示：在本實驗周期內(nèi)，健康大鼠

牙槽骨內(nèi)鈣磷含量略低于頜骨內(nèi)鈣磷含量，ALP活性高于頜骨內(nèi)ALP活性，此結(jié)果可能與牙槽骨內(nèi)松質(zhì)骨含量較多、局部機械刺激等促進骨代謝有關(guān)。

3.3 尼古丁對不同部位骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性的

影響

Levin等[14]通過流行病學研究發(fā)現(xiàn)吸煙者牙槽骨的密度和高度明顯低于非吸煙者。劉潁鳳等[12]研究

表明尼古丁使鼠牙槽骨高度輕度降低并呈劑量依賴性，CT掃描發(fā)現(xiàn)骨密度、骨體積分數(shù)、骨小梁厚度的值與尼古丁給藥劑量呈負相關(guān)，骨小梁間隙值高于對照組。Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)隨著尼古丁濃度的增加，礦化結(jié)節(jié)形成顯著減少；低濃度時ALP活性與對照組無明顯差異，隨濃度的增加，ALP活性隨之降低。研究[4]指出低濃度的尼古丁促進成骨細胞的增殖并提高ALP活性，促進Ⅰ型膠原的合成，但高濃度時則抑制細胞的增殖和骨的代謝。研究[4-5]還表明尼古丁參與成骨細胞的分化是由于尼古丁導致細胞膜的除極化，繼而結(jié)合煙堿受體，激活電位依賴的Ca2+通道，通過鈣離子信號途徑而完成。本實驗結(jié)果表明：在本實驗周期內(nèi)，實驗組大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量明顯減少（P<0.05），ALP活性無顯著性差異（P>0.05）；實驗組大鼠牙槽骨和頜骨內(nèi)鈣磷含量和ALP活性均無明顯差異（P>0.05）。結(jié)果顯示尼古丁均下調(diào)牙槽骨和頜骨鈣磷含量，卻沒有明顯影響ALP活性，此結(jié)果可能與尼古丁濃度和實驗周期有關(guān)。筆者推測尼古丁對成骨細胞的抑制作用并非完全通過降低ALP活性完成，可能通過鈣化相關(guān)的非膠原蛋白參與完成。因此尼古丁對骨形成影響的分子機制還需要進一步的實驗研究。

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（本文采編 王晴）