胡曉，胡靜波，董少華，蘇衛(wèi)，陳鷹 （.廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，湖北 武漢40070；2.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢40065；.南方醫(yī)科大學，廣東 廣州5055）

凝膠膏劑（原稱巴布膏劑）是以水溶性高分子聚合物為基質(zhì)骨架材料的新型外用貼劑，其載藥量大，保濕性強，透皮性好，皮膚舒適度高，可反復揭貼，無刺激性，明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的貼膏劑。復方積雪草苷凝膠膏劑是我院新研制的醫(yī)院制劑，由積雪草苷、醋酸曲安萘德、維生素E 等組成；其中積雪草苷可抑制成纖維細胞的DNA 合成［1］，從而抑制瘢痕增生；醋酸曲安萘德可促進膠原降解［2］；維生素E 能夠滋潤和保護皮膚；本實驗將幾味藥聯(lián)用，并采用新型透皮貼膏劑劑型，不僅可使藥物持續(xù)地發(fā)揮協(xié)同作用，凝膠膏劑自身的粘附壓力，還可進一步抑制瘢痕的形成。為證實所研制的復方積雪草苷凝膠膏劑的透皮效果，本文采用改良Franz擴散池法，考察了不同促滲劑如月桂氮芯卓酮、丙二醇、薄荷醇對主藥積雪草苷和醋酸曲安奈德的體外經(jīng)皮滲透的影響。

1 材料

1100型高效液相色譜儀（安捷倫公司，美國）；AB204－N 電子分析天平（梅特勒—托利多儀器上海有限公司生產(chǎn)）；YB－P6智能透皮試驗儀（天津藥典標準儀器廠）；SHY02型實驗室中藥凝膠膏劑小型成型機（天津大學制造）；TDL－60B 低速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；85－2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂科學儀器廠）。

積雪草苷（廣西昌洲天然藥業(yè)有限公司，含量：80%，批號110926）；積雪苷霜軟膏［規(guī)格：0.25g／10g（以積雪草總苷計），上?，F(xiàn)代制藥股份有限公司，批號110303］；積雪草苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號110892－200604）；醋酸曲安奈德（天津天藥藥業(yè)股份有限公司，含量：99.6%，批號110601）；醋酸曲安奈德對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100125－200404）；醋酸曲安奈德乳膏（規(guī)格：5mg／20g，唐山紅星藥業(yè)有限責任公司，批號20110104）；β－環(huán)糊精（安徽山河藥業(yè)有限公司）；聚丙烯酸鈉NP－700（國際特品公司）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP－K90，國 際 特 品 公 司）；羧 甲 基 纖 維 素 鈉（CMC－Na，武漢德合昌食品添加劑有限公司）；維生素E（德國巴斯夫維生素有限公司）；丙二醇（湖南爾康制藥有限公司）；月桂氮芯卓酮（天門科捷制藥有限公司）；薄荷醇（安徽太島薄荷藥業(yè)有限公司）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）。

昆明種小鼠，雌性，10只，體質(zhì)量18～20g，武漢大學動物實驗中心提供，許可證號SCXK－（鄂）2008－0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 復方積雪草苷凝膠膏劑的制備

2.1.1 不含促滲劑的復方積雪草苷凝膠膏劑的制備 根據(jù)預實驗的結(jié)果，初步確定凝膠膏劑基質(zhì)的優(yōu)化處方為：聚丙烯酸鈉∶PVP－K90∶CMC－NA∶高嶺土＝5∶2∶1∶2。按處方量稱取聚丙烯酸鈉、聚山梨酯80、CMC－Na、甘氨羥鋁、高嶺土、二氧化鈦分散于甘油中，加入適量苯氧乙醇，混勻，作為油相備用；另取處方量的積雪草苷、PVP－K90、酒石酸、EDTA－4Na、加適量純化水，磁力攪拌至澄清透明液體，加入適量苯氧乙醇，混勻，作為水相備用。稱取處方量的醋酸曲安萘德，維生素E 于適量乙醇中，混勻后加入至上述油相。油相和水相置于減壓真空干燥器中反復抽真空以除去氣泡，再將水相緩慢加至油相中，迅速攪勻，上機均勻涂布于無紡布上，同時蓋膜，剪裁為7cm×10cm 大小，鋁箔袋密封包裝，貼標簽即得成品。成品中每100g 藥膏含積雪草總苷2.5g和醋酸曲安奈德25mg。

2.1.2 含不同促滲劑復方積雪草苷凝膠膏劑的制備 根據(jù)上述處方，將不同促滲劑（A 含1%月桂氮芯卓酮，B含1%丙二醇，C 含0.5%薄荷醇，D 含1%月桂氮芯卓酮及1%丙二醇）分別加至油相，按照“2.1.1”方法項下制備含不同促滲劑復方積雪草苷凝膠膏劑。

2.2 主藥含量測定HPLC方法學的建立

2.2.1 HPLC測定積雪草苷含量方法的建立

（1）色譜條件［4］：色譜柱為Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－2mmol·L－1－β－環(huán)糊精（24∶76）；檢測波長205nm；流速1.0 mL·min－1；進樣量20μL；柱溫35 ℃。

（2）對照品溶液的制備：取積雪草苷對照品5 mg，精密稱定，置5mL 量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成1mg·mL－1的標準儲備液。

（3）供試品溶液的制備：將體外透皮試驗取出的接受液用0.45μm 微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

（4）標準曲線的制備：取積雪草苷儲備液適量，分別制成800，400，200，100，50，25，12.5μg·mL－1的7份標準溶液，按上述色譜條件進樣，測得峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為：A＝78.469C＋418.5，r＝0.999 3。結(jié) 果 表 明 積 雪 草 苷 在12.5～800 μg·mL－1與峰面積的線性關(guān)系良好。

（5）精密度試驗：取上述線性關(guān)系考察項下的低、中、高3種質(zhì)量濃度（12.5，100，800μg·mL－1）進行分析，每種濃度的溶液重復進樣4次，測定峰面積，計算其日內(nèi)精密度RSD。結(jié)果其日內(nèi)精密度的RSD 分別為0.37%、0.42%、0.63%，表明精密度良好。

（6）穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，按照上述色譜條件分別于0，1，2，4，8，12，24h進樣，測定積雪草苷峰面積，計算其含量RSD 為0.94%（n＝7），結(jié)果表明該供試品中積雪草苷在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

（7）重復性試驗：取同一樣品體外透皮試驗的接收液6份，按“2.2.1（3）”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，測定峰面積，計算其含量RSD 為0.76%（n＝6），表明本方法的重復性良好。

（8）回收率試驗：在12h空白皮膚滲透液中加入一定量積雪草苷對照品，制成低中高濃度分別為25，100，400μg·mL－1的系列溶液，按上述色譜條件進樣，測定峰面積，計算其平均回收率為98.54%。結(jié)果見表1。

表1 積雪草苷回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery（n＝6）

2.2.2 HPLC測定醋酸曲安奈德含量方法的建立（1）色譜條件［6］：色譜柱為Hypersil BDS C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相為甲醇－水（60∶40）；檢測波長240nm；流速1.0mL·min－1；進樣量20μL；柱溫35 ℃。（2）對照品溶液的制備：取醋酸曲安奈德對照品1mg，精密稱定，置50mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，配制成20μg·mL－1的標準儲備液。（3）供試品溶液的制備：將體外透皮試驗取出的接受液用0.45μm 微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。（4）標準曲線的制備：取醋酸曲安奈德儲備液適量，分別制成8，4，2，1，0.5，0.25，0.05μg·mL－1的7份標準溶液，按上述色譜條件進樣，測得峰面積。以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得 回 歸 方 程 為：A ＝101.2 C－1.651，r＝0.999 9。結(jié)果表明醋酸曲安奈德在0.05～8μg·mL－1與峰面積的線性關(guān)系良好。（5）精密度試驗：取上述線性關(guān)系考察項下的低、中、高3種質(zhì)量濃度（0.05，1，8μg·mL－1）進行分析，每種濃度的溶液重復進樣4次，測定峰面積，計算其日內(nèi)精密度RSD。結(jié)果其日內(nèi)精密度的RSD分別為0.50%，0.32%，0.79%，表明精密度良好。（6）穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，按照上述色譜條件分別于0，1，2，4，8，12，24h進樣，測定醋酸曲安奈德峰面積，計算其含量RSD 為0.86%（n＝7），結(jié)果表明該供試品中醋酸曲安奈德在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。（7）重復性試驗：取同一樣品體外透皮試驗的接收液6份，按“2.2.2（3）”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進樣，測定峰面積，計算其含量RSD 為0.52%（n＝6），表明本方法的重復性良好。

（8）回收率試驗：在12h空白皮膚滲透液中加入一定量醋酸曲安奈德對照品，制成低、中、高濃度分別為0.25，1，4μg·mL－1的系列溶液，按上述色譜條件進樣，測定峰面積，計算其平均回收率為99.43%。結(jié)果見表2。

表2 醋酸曲安奈德回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 2 Results of recovery（n＝6）

2.3 體外透皮試驗法篩選透皮吸收促進劑

2.3.1 離體皮膚的制備［3］取18～20g昆明種小鼠，實驗前24h先用剪刀剪去腹部絨毛，再用5%的硫化鈉褪毛，然后將小鼠頸椎脫臼處死，取下無破損的腹部皮膚置干凈的玻璃板上，用刀片小心剔除皮下脂肪組織及黏連物，生理鹽水反復沖洗干凈，修剪成合適大小，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。實驗時取出，室溫下自然解凍，每次實驗前應(yīng)目視檢查皮膚的完整性。

2.3.2 體外透皮試驗方法 Franz擴散池的接受池體積為16 mL，擴散面積為1cm2。實驗時從冰箱中取出鼠皮，室溫下自然解凍，以生理鹽水洗凈，用濾紙吸干表面水分，凝膠膏劑剪成相應(yīng)大小緊密貼于鼠皮的角質(zhì)層，離體皮膚的真皮層面向接受室，排盡皮膚下的空氣。接收液為生理鹽水。水浴恒溫至37 ℃，磁力攪拌轉(zhuǎn)速為400r·min－1。預平衡30 min后開始實驗，于0.5，1，2，4，8，12，24h從樣品接受室中取出1mL，同時補加等量同溫的接收液至接受室，將取出的接收液樣品經(jīng)0.45μm 微孔濾膜過濾，供HPLC進樣分析，測定藥物濃度，計算單位面積累積滲透量。

2.3.3 藥物皮內(nèi)滯留量的測定 透皮實驗結(jié)束后，取下離體皮膚置小燒杯中，眼科剪剪碎皮膚組織，移至玻璃勻漿器中搗碎，加入適量甲醇萃取3次，合并萃取液置EP管，氮氣揮干，1mL 甲醇溶解殘留物，以12 000r·min－1的轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液進樣。計算藥物皮內(nèi)滯留量Qm。

圖1 復方積雪草苷凝膠膏劑中積雪草苷體外累計透過量－時間曲線圖（n＝3）—◆—含1%月桂氮芯卓酮及1%丙二醇組；—□—含1%月桂氮芯卓酮組；—▲—含0.5%薄荷醇組；——含1%丙二醇組；—●—不含促滲劑組；—■—市售積雪苷霜組Fig 1 The asiaticoside accumulative release curve of compound asiaticoside cataplasm in the percutaneous absorption（n＝3）—◆—1% azone＋1% 1，2－di－h(huán)ydroxypropane；—□—1% azone；—▲— 0.5% menthol；——1，2－di－h(huán)ydroxypropane；—●—blank group；—■—asiaticoside cataplasm

圖2 復方積雪草苷凝膠膏劑中醋酸曲安奈德體外累計透過量－時間曲線圖（n＝3）—◆—市售醋酸曲安奈德組；—■—含1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇組；—▲—含1%月桂氮芯卓酮組；—●—含1%丙二醇組；——含0.5%薄荷醇組；—□—不含促滲劑組Fig 2 The triamcinolone acetonide acetate accumulative release curve of compound asiaticoside cataplasm in the percutaneous absorption（n＝3）—◆—triamcinolone acetonide acetate；—■—1%azone＋1%1，2－dihydroxypropane；—▲—1% azone；—●—1% 1，2－di－h(huán)ydroxypropane；——0.5% menthol；—□—blank group

結(jié)果分析：與不含促滲劑的凝膠膏劑相比，含有促滲劑的積雪草苷和醋酸曲安奈德的單位面積累積滲透量，滲透速率，皮內(nèi)滯留量均明顯增加。各組促滲劑對積雪草苷的促滲能力大小為1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞1%月桂氮芯卓酮＞0.5%薄荷醇＞1%丙二醇。各組促滲劑對醋酸曲安奈德的促滲能力大小為1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞1%月桂氮芯卓酮＞1%丙二醇＞0.5%薄荷醇。與市售制劑比較，1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇組對積雪草苷和醋酸曲安奈德的透皮速率，單位面積累積滲透量明顯增高。比較各組的積雪草苷皮膚角質(zhì)層滯留量，結(jié)果為1%月桂氮芯卓酮＞1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞0.5%薄荷醇＞1%丙二醇，應(yīng)用1%月桂氮芯卓酮為促滲劑時，積雪草苷的皮膚角質(zhì)層滯留量最大。比較各組的醋酸曲安奈德皮膚角質(zhì)層滯留量，結(jié)果為1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇＞1%月桂氮芯卓酮＞1%丙二醇＞0.5%薄荷醇。即當1%月桂氮芯卓酮與1%丙二醇聯(lián)合使用時，可促進積雪草苷和醋酸曲安奈德的透皮吸收。因此，1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇可作為復方積雪草苷凝膠膏劑的促滲劑。

3 討論

目前，常用的促滲劑有數(shù)十種，本文在預實驗的結(jié)果的基礎(chǔ)上，并參考相關(guān)報道［5－6］，重點考察了月桂氮芯卓酮、丙二醇及薄荷醇對透皮吸收的影響。在預實驗中曾分別考察了不同濃度的月桂氮芯卓酮，丙二醇及薄荷醇對透皮吸收和基質(zhì)性能的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)用單一促滲劑時，1%月桂氮芯卓酮與2%月桂氮芯卓酮的促滲能力無顯著差異，3%月桂氮芯卓酮的促滲能力最強，但3%月桂氮芯卓酮組凝膠膏劑的表面有滲油現(xiàn)象，黏性小，防黏層可直接撕開，影響成品的外觀性狀。不同濃度丙二醇的促滲作用并不隨著其濃度增加而增加，丙二醇的濃度為1%時較好。由于增生性瘢痕皮膚角質(zhì)細胞脆性高，表面有許多裂紋，角質(zhì)層的屏障功能減弱［7］，且薄荷醇清涼具有刺激性，因此，薄荷醇的濃度為0.5%較合適。應(yīng)用二元促滲劑時，1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇組的促滲能力最強。

表3 積雪草苷經(jīng)皮滲透動力學參數(shù)結(jié)果（n＝3）Tab 3 Permeation kinetic parameters of asiaticoside（n＝3）

表4 醋酸曲安奈德經(jīng)皮滲透動力學參數(shù)結(jié)果（n＝3）Tab 4 Permeation kinetic parameters of triamcinolone acetonide acetate（n＝3）

考察不同促滲劑對復方積雪草苷凝膠膏劑中兩個主要成分積雪草苷和醋酸曲安奈德的影響，結(jié)果表明采用1%月桂氮芯卓酮＋1%丙二醇作為促滲劑，可顯著提高兩藥的透皮效果；通過Higuchi方程擬合比較，含促滲劑組與不含促滲劑組凝膠膏劑中積雪草苷符合Higuchi方程釋放規(guī)律；醋酸曲安奈德符合零級緩釋規(guī)律，起到24h穩(wěn)定釋放效果。

本實驗制備的復方積雪草苷巴布劑為交聯(lián)型巴布劑，基質(zhì)中甘氨酸鋁的高價金屬離子與水溶性聚合物聚丙烯酸鈉形成交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以充盈大量水分和藥物。藥物的透皮吸收分為釋放，穿透，吸收三個過程。脂溶性的醋酸曲安奈德易于穿過皮膚類脂分子層，但是從水溶性基質(zhì)中釋放成為其透皮吸收的限速過程，因此，在前8h，凝膠膏劑中醋酸曲安奈德的釋放較緩慢。市售醋酸曲安奈德乳膏釋藥相對較快，而從劑型角度來看，衣物摩擦會造成藥物損失，影響藥物釋放。

皮膚角質(zhì)層是許多藥物透皮吸收的一道生理屏障，尤其是水溶性藥物較難透過皮膚［8］，在角質(zhì)層中的擴散是其主要的限速過程。應(yīng)用透皮吸收促進劑可降低藥物通過皮膚阻力，加速藥物穿透皮膚。月桂氮芯卓酮進入角質(zhì)層后可擴大角質(zhì)層細胞間隙，提高通過細胞間隙水溶性藥物的透過量，同時，可對原有的脂質(zhì)進行重排，從而增加藥物通過角質(zhì)層的滲透性。丙二醇可增加角質(zhì)層的水合作用，提高類脂的流動性，促進藥物的吸收，但是丙二醇與月桂氮芯卓酮聯(lián)合應(yīng)用時促滲效果明顯強于丙二醇單用的效果。

本實驗曾考察了以生理鹽水和磷酸鹽緩沖液PBS 7.4為透皮接受液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用磷酸緩沖液PBS 7.4時，對藥物測定有干擾；而以生理鹽水為接收液時，空白接受液不干擾藥物的檢測，峰形較好。

有關(guān)市售的抑制疤痕增生的藥物，臨床多為激素注射，或中藥治療，往往造成不良反應(yīng)或療效不佳；實驗選用有確切療效的藥物組合，結(jié)合新型透皮貼膏劑的釋藥特性以及其本身的黏附壓力物理治療，達到持續(xù)有效地釋放藥物，為臨床疤痕的治療提供新制劑和實驗基礎(chǔ)。

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