關(guān)為群，陳雅瑜 （.福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院，福建 福州35000；.福建醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，福建 福州350004）

辛伐他汀（simvastatins）為甲基羥戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶的特異性競爭抑制劑，抑制內(nèi)源性膽固醇的合成，是臨床上應(yīng)用廣泛的血脂調(diào)節(jié)藥。近年來發(fā)現(xiàn)他汀類藥物還具有不依賴于其降脂效果的其他多樣性的保護(hù)作用。其抗氧化和抗炎作用，能治療多種炎癥組織［1］；誘導(dǎo)形成血管、促使神經(jīng)細(xì)胞存活并能促進(jìn)其形成神經(jīng)；促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，形成新骨［2］。目前，辛伐他汀在口腔領(lǐng)域的應(yīng)用受到了廣大學(xué)者的關(guān)注。辛伐他汀能治療多種炎癥組織，但對(duì)炎癥牙髓組織的效果需進(jìn)一步探討。Yazawa等［3］證實(shí)：辛伐他汀對(duì)牙周膜細(xì)胞（periodontal ligament cells，PDLCs）的 增 殖 有 劑 量 依 賴性，但是辛伐他汀對(duì)牙髓細(xì)胞（human dental pulp cells，hDPCs）影響的研究尚少，而對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的炎癥牙髓細(xì)胞的影響更是未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在研究不同濃度辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞及脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)hDPCs增殖的影響，為辛伐他汀在牙髓炎領(lǐng)域的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 三級(jí)生物安全防護(hù)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室（PⅢ）；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱（Heal force HF－90，美國）；生物安全柜（Heal force SW－CJ－2F，上海力申）；倒置相差顯微鏡（Nikon TS－100，日本）；酶聯(lián)檢測儀（Biotek POWERWAVE，美國）；6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Costor，美國）。

低糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清FBS、胰蛋白酶、EDTA 均為美國Gibco 公司；辛伐他汀、脂多糖、二甲基亞砜（DMSO）均為美國Sigma 公司；CCK－8（同仁，日本）。

1.2 hDPCs培養(yǎng) 取18～24歲需劈冠的阻生牙，術(shù)中無菌狀態(tài)取劈冠露髓的牙齒置于含雙抗的PBS中；無菌狀態(tài)下取出牙髓組織，并棄根髓1／3，PBS反復(fù)沖洗，去除血污；并將牙髓組織剪成1 mm×1 mm 小塊，置于六孔板中，在組織塊上蓋上蓋玻片，每孔加含100μg·mL－1青霉素、100μg·mL－1鏈霉素的20%FBS DMEM 培養(yǎng)液2 mL；37 ℃、CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)抗波形絲蛋白抗體和抗角蛋白抗體鑒定后，用0.25%的胰蛋白酶、0.02%EDTA 的混合消化液進(jìn)行傳代，取第4～7代hDPCs用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 hDPCs的最佳接種密度選擇 取對(duì)數(shù)生長的第2代hDPCs，以2×103／孔、4×103／孔、6×103／孔及8×103／孔接種于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用含5%FBS DMEM 培養(yǎng)液于37 ℃、CO2培養(yǎng)箱；孵育24h后每孔加入10μLCCK－8，分別在其加入后的1，2，3h測其OD 值。

1.4 不同級(jí)別濃度的辛伐他汀對(duì)正常hDPCs增殖的影響 取生長良好的第4代hDPCs，以適宜接種于96 孔板，每孔加100μL 細(xì)胞懸液，以5%FBS DMEM 培養(yǎng)液在37℃、CO2培養(yǎng)箱中孵育24h后，用PBS洗滌3次。實(shí)驗(yàn)共設(shè)不同濃度的辛伐他汀實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組；其中實(shí)驗(yàn)組使辛伐他汀終濃度為0.001，0.01，0.1，1μmol·L－1的5%FBS DMEM培養(yǎng)液，空白對(duì)照為僅含5%FBS DMEM 培養(yǎng)液。每組設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，每孔加入相應(yīng)的含藥物培養(yǎng)基100μL。在觀察的1，3，5，7，10d，每孔加入10μL CCK－8后，繼續(xù)培養(yǎng)3h，檢測450nm 波長的OD值。

1.5 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)正常hDPCs及LPS誘導(dǎo)的hDPCs的干預(yù) 取生長良好的第4代hDPCs，以適宜接種于96孔板，每孔加100μL 細(xì)胞懸液，以5%FBS DMEM 培養(yǎng)液在37 ℃、CO2孵育箱中孵育24h后，用PBS洗滌3次。實(shí)驗(yàn)分10組，分別為：正常hDPCs對(duì)照組、LPS 誘導(dǎo)hDPCs對(duì)照組、4種不同濃度辛伐他汀＋正常hDPCs干預(yù)組、4種不同濃度辛伐他?。獿PS 誘導(dǎo)hDPCs干預(yù)組（LPS的誘導(dǎo)正常hDPCS 的質(zhì)量濃度為10 mg·L－1）。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，每孔液量為100μL。在觀察的1，3，5，7d，每孔加入10μL CCK－8后，繼續(xù)培養(yǎng)3h，檢測450nm 波長的OD。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以±s表示，多組間采用方差分析，2組間比較采成組t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05（P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義）。

2 結(jié)果

2.1 hDPCs的形態(tài)及鑒定 培養(yǎng)皿中蓋玻片將所有組織塊固定在底壁，在培養(yǎng)的第6天見部分組織塊周圍有散在的hDPCs爬出（圖1A），其形態(tài)為長梭形，胞體豐滿，胞突細(xì)長，胞質(zhì)均勻，核圓形或卵圓形，聚集成旋渦狀（圖1B）。免疫組化染色結(jié)果顯示：hDPCs抗波形蛋白染色陽性，角蛋白染色陰性（圖2）。

圖1 人牙髓細(xì)胞原代培養(yǎng)（×100）A.原代第6天；B.原代第15天Fig 1 Primary HDPC isolation and expansion（×100）A.primary HDPC at 6days；B.primary HDPC at 15days

圖2 第2代hDPCs波形蛋白和角質(zhì)蛋白鑒定（×100）A.波形蛋白染色；B.角質(zhì)蛋白染色Fig 2 Identification of waveform silk and Keratin protein on the second HDPCs（×100）A.expression of waveform silk protein；B.expression of Keratin protein

2.2 hDPCs接種密度生長曲線 根據(jù)加入CCK－8后，不同時(shí)間點(diǎn)測不同接種密度hDPCs的OD 值畫出折線圖（圖3）。進(jìn)行線性趨勢分析，加入CCK－8后測1，2，3h的OD 值發(fā)現(xiàn)：以上3個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞接種密度在2×103／孔～8×103／孔之間，同細(xì)胞OD 值呈線性關(guān)系；而3h的相關(guān)性相對(duì)于其他2組較強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)考慮到觀察周期比較長，選擇2×103／孔作為合適的接種密度，并且在CCK－8加入后3h測其OD 值。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)不同接種密度hDPCs的OD值Fig 3 OD of different hDPCs seeding density at different time points

2.3 不同濃度的辛伐他汀對(duì)正常hDPCs增殖的影響 CCK－8比色OD 值表明（表1），辛伐他汀單獨(dú)作用于hDPCs，藥物濃度為0.001μmol·L－1及0.1 μmol·L－1隨著時(shí)間延長雖能促進(jìn)hDPCs增殖，但與對(duì)照組相比卻無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高濃度（1μmol·L－1）則隨著時(shí)間延長明顯抑制hDPCs增長（P＜0.05）。0.01μmol·L－1組第1天就能促進(jìn)hDPCs增殖，但其在第3天起對(duì)hDPCs增殖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。成組t檢驗(yàn)分析，空白對(duì)照組第7天與第10天的OD 值相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 特定濃度辛伐他汀對(duì)正常hDPCs及LPS 誘導(dǎo)的hDPCs的作用 從“2.3”項(xiàng)統(tǒng)計(jì)分析得出0.01 μmol·L－1組辛伐他汀對(duì)正常hDPCs增殖有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，進(jìn)一步選擇0.005，0.01，0.015，0.05 μmol·L－1組觀察辛伐他汀對(duì)正常hDPCs和LPS誘導(dǎo)的hDPCs干預(yù)作用。

CCK－8比色比較辛伐他汀干預(yù)正常hDPCs增殖情況（表2）：0.005，0.01μmol·L－1組從第1天起對(duì)正常hDPCs促進(jìn)增殖作用，而其在第3天后有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而10mg·L－1LPS第1天起促進(jìn)hDPCs增殖，但僅在第3天及第5天有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表3）；0.005，0.01，0.015，0.05 μmol·L－1組從第1 天起都抑制hDPCs的增殖，而0.01μmol·L－1組的抑制效果最明顯，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

3 討論

辛伐他汀除了調(diào)節(jié)血脂作用外，還有抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)血管生成素合成，改善內(nèi)皮功能，抑制平滑肌增殖作用［4］和促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，形成新骨。目前辛伐他汀在口腔領(lǐng)域的少量研究集中在其對(duì)牙周膜細(xì)胞及成骨細(xì)胞的研究，而對(duì)牙髓細(xì)胞的研究尚少。牙髓細(xì)胞是牙髓組織的主要細(xì)胞，而牙髓細(xì)胞的增殖是牙髓和牙本質(zhì)發(fā)育及修復(fù)中的必備條件之一［5］。但臨床上，因?yàn)檠浪柩祝╬ulpitis）作為牙髓病中的最主要疾病，更多的是牙髓細(xì)胞通常受到細(xì)菌等致病因素的侵襲。LPS 是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分，也是其重要致病因子；其主要通過2條途徑作用于牙髓細(xì)胞，一條是刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，在作用于牙髓細(xì)胞，另一條是直接作用與牙髓細(xì)胞，引起其生物學(xué)特性發(fā)生改變。研究辛伐他汀對(duì)正常hDPCs和LPS 誘導(dǎo)hDPCs的影響有助于為臨床上生理性和病理性的牙髓再生提供思路。

表1 不同濃度辛伐他汀對(duì)hDPCs增殖的影響（±s，n＝4）Tab 1 The effects of simvastatin on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

表1 不同濃度辛伐他汀對(duì)hDPCs增殖的影響（±s，n＝4）Tab 1 The effects of simvastatin on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

注：與空白對(duì)照組比較，aP＜0.05，b P＜0.001

表2 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 2 The effects of simvastatin with the different concentrations on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

表2 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)人正常牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 2 The effects of simvastatin with the different concentrations on multiplication situation of hDPCs（±s，n＝4）

注：與空白對(duì)照組比較：aP＜0.05，b P＜0.01

表3 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 3 The effects of simvastatin with the different concentration on multiplication situation of LPS－induced hDPCs（±s，n＝4）

表3 特定級(jí)別濃度辛伐他汀對(duì)LPS誘導(dǎo)人牙髓細(xì)胞增殖的影響（±s，n＝4）Tab 3 The effects of simvastatin with the different concentration on multiplication situation of LPS－induced hDPCs（±s，n＝4）

注：含LPS空白對(duì)照組與含血清空白對(duì)照組比較，aP＜0.05；0.005，0.01，0.015，0.05μmol·L－1辛伐他汀干預(yù)組與含LPS空白對(duì)照組比較，b P＜0.05，c P＜0.01

之前的研究表明，由于細(xì)胞的種類、他汀類的類型及其濃度不同，辛伐他汀對(duì)細(xì)胞的增殖影響也不一樣。他汀類（包括辛伐他?。┮种破交〖?xì)胞和內(nèi)皮細(xì) 胞 的 增 殖［6－9］，卻 促 進(jìn) 纖 維 細(xì) 胞 的 增 殖［7］。Yazawa等［3］用MTT 法發(fā)現(xiàn)：24h的0.1，1μmol·L－1辛伐他汀促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，72h 的0.1 μmol·L－1辛伐他汀抑制牙周膜細(xì)胞增殖；而其BRDU 分析發(fā)現(xiàn)：24h的0.001，0.01，0.1μmol·L－1辛伐他汀促進(jìn)牙周膜細(xì)胞增殖，72h的1μmol·L－1組辛伐他汀抑制牙周膜細(xì)胞增殖。

本實(shí)驗(yàn)采用CCK－8法測細(xì)胞活性，其生成的甲臜物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比，利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖分析。由于96孔板每孔生長面積僅為0.34cm2，細(xì)胞接種密度的多少與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性密切相關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過接種不同密度的細(xì)胞，計(jì)算細(xì)胞接種密度同OD 值間的線性關(guān)系，來確定合適的細(xì)胞接種密度，以排除細(xì)胞接種密度對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。

本實(shí)驗(yàn)顯示，在未經(jīng)任何處理的對(duì)照組hDPCs保持持續(xù)增殖能力，其第7 天與第10 天無顯著區(qū)別，可能是因?yàn)榧?xì)胞大量增長產(chǎn)生了接觸抑制。加入不同級(jí)別濃度的辛伐他汀，1μmol·L－1組對(duì)hDPCs有抑制作用；0.001，0.01，0.1μmol·L－1組辛伐他汀均有促進(jìn)hDPCs增殖的作用，但只有0.01μmol·L－1組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且增殖效果最佳，是否0.001～0.1μmol·L－1之間有一個(gè)比0.01 μmol·L－1增殖效果更強(qiáng)的濃度？所以我們對(duì)正常hDPCs增殖有意義的0.01μmol·L－1這一級(jí)別的藥物濃度進(jìn)一步細(xì)化，觀察其對(duì)正常和炎癥牙髓細(xì)胞的作用。

LPS是牙髓炎的誘發(fā)因素之一，并且在炎癥牙髓組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了LPS。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Lee［10］和Kim［11］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇10 mg·L－1LPS 誘導(dǎo)hDPCs模擬炎癥牙髓細(xì)胞。10mg·L－1LPS從第一天起促進(jìn)hDPCs增殖，與Lee等［10］的結(jié)果相一致。Lee等研究發(fā)現(xiàn)10mg·L－1LPS能促進(jìn)hDPCs的增殖，且細(xì)胞間黏附分子（intracellular adhesion molecule－1，ICAM－1）和血管黏附分子（vascular cell adhesion molecule－1，VCAM－1）表達(dá)量也最高，這2種黏附分子是牙髓組織對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)產(chǎn)物。但第7天雖然對(duì)hDPCs有增殖效果，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是因?yàn)殚L期LPS會(huì)導(dǎo)致hDPCs慢慢變性壞死。

0.005，0.01，0.015，0.05μmol·L－1辛 伐 他 汀作用于人正常牙髓細(xì)胞及LPS誘導(dǎo)的人牙髓細(xì)胞，結(jié)果0.005μmol·L－1及0.01μmol·L－1辛伐他汀從第1天起促進(jìn)hDPCs的增殖，而0.01μmol·L－1組增殖效果較好；以上4種濃度的辛伐他汀從第1天起抑制LPS誘導(dǎo)的hDPCs增殖，而0.01μmol·L－1的抑制效果最明顯。Kim 等［12］發(fā)現(xiàn)辛伐他汀促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，其表現(xiàn)出了典型的半胱天冬酶依賴的凋亡特征，即核DNA 降解、金屬基質(zhì)蛋白酶的分裂和半胱天冬酶－3的激活。

綜上所述，高濃度（1μmol·L－1）辛伐他汀明顯抑制正常hDPCs的增殖。而0.01μmol·L－1辛伐他汀能促進(jìn)人正常的hDPCs增殖，而抑制了LPS 誘導(dǎo)的hDPCs的增殖；適宜藥物濃度的確定為我們下一步研究牙髓炎的動(dòng)物模型提供基礎(chǔ)。

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