徐富勇 徐玲 劉仁榮 裘雪梅 朱立鑫

（1.南昌大學生命科學與食品工程學院，南昌 330029； 2.江西科技師范大學生命科學學院，南昌 330013）

霉菌毒素是由真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，污染的食物種類繁多，對動物和人體都有較強的毒副作用。玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）是非類固醇雌激素霉菌毒素，主要源于鐮刀菌［1］。ZEN的產(chǎn)生是一個長期陰冷潮濕與多因素相互作用的結(jié)果，如谷物的水分含量，感染情況，溫度和微生物作用等，以及其他未知因素［2］。在玉米、高粱、小麥、大麥燕麥，以及由此為原料制作的食品中都能找到ZEN的蹤跡［3，4］。在摩洛哥，ZEN已經(jīng)在玉米中被發(fā)現(xiàn)，平均含量為14 ng/g［5］，在保加利亞的小麥中，ZEN是主要的霉菌毒素，占69%，平均含量為17 ng/g［6］。由于這種霉菌毒素的誘變、遺傳毒性和致癌作用尚不清楚，國際癌癥研究中心（IARC）將其歸為3 類致癌物質(zhì)［7］。但是有人提出ZEN和人類的子宮頸癌和子宮內(nèi)膜增生之間可能存在聯(lián)系［8］，另有學者［9，10］在中國發(fā)現(xiàn)，ZEN和食道癌可能有關系。雖然玉米赤霉烯酮及其衍生物和人類的潛在致癌性之間的聯(lián)系仍然存在爭議，但在實驗室動物試驗中，已取得其具有致癌性的有力證據(jù)［11］。

目前常用檢測ZEN的方法有熒光光度計法［12］、氣相色譜法［13］、高效液相色譜法［14］及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［15］等，但這些技術都存在操作要求和成本偏高等問題。ELISA具有檢測速度快，靈敏度高，可定量，操作簡便，成本低等特點，已經(jīng)被廣泛應用于各種真菌毒素的快速檢測。但ELISA方法中需要使用ZEN標準品合成人工抗原，由于ZEN對人體有危害性，而且其標準品價格昂貴，獲取困難，所以開發(fā)出一種能模擬ZEN反應原性，能代替ZEN進行試驗的無毒物質(zhì)顯得很有必要。本試驗在何慶華等［16］研究的基礎上，查詢到ZEN模擬表位肽為DAVILLM，多肽對應堿基序列：GATGCTGTCATCCTGTTGATG。pC89是帶有來源于f1噬菌體的gpⅧ、f1噬菌體的復制起點，以及在pMBI質(zhì)?；A上新添加兩個酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ而的到的噬菌粒。gpⅧ較小，適合融合模擬表位這類較小的肽段，而且gpⅧ拷貝數(shù)極多，可達2 700個，在高密度表達方面具有明顯的優(yōu)勢。pC89S4是改進的pC89，它在BamHⅠ與EcoRⅠ酶切位點之間引入XbaⅠ酶切位點，在酶切驗證時更直觀準確。通過構(gòu)建pC89-CZEN表達載體，將含有玉米赤霉烯酮抗原表位基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，用KM13超感染后，純化得到玉米赤霉烯酮抗原表位的噬菌體顆粒，結(jié)合ELISA測定方法，驗證表達的模擬多肽的反應原性的同時檢測其表達效果，以期開發(fā)出來可以代替ZEN標準品的無毒檢測ZEN毒素的ELISA試驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TG1、XL1-Blue（江西科技師范學院生命科學學院保存）； pC89S4噬菌粒（第三軍醫(yī)大學免疫研究所萬瑛教授惠贈）；輔助噬菌體KM13（江西科技師范學院生命科學學院保存）；限制性內(nèi)切酶 EcoR I、BamH I、Xba I、T4 DNA 連接酶及PCR擴增套裝（寶生物工程（大連）有限公司）；質(zhì)粒提取試劑盒、PCR純化試劑盒（深圳Fermentas公司）；DNA Marker（杭州愛思進生物公司）；人工抗原BSA-GMBS-ZEN（本實驗室合成）；寡聚核苷酸單鏈T1、T2由上海Sangon合成并測序；辣根過氧化物酶標記羊抗鼠IgG（Sigma公司）；ZEN抗體（南昌博恒生物工程公司）；洗板機（Thermo公司）；酶標儀（Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 ZEN-PⅧ噬菌體展示載體的構(gòu)建 ZEN模擬表位肽為DAVILLM，對應堿基序列：GATGCTGTCATCCTGTTGATG，考慮到原模擬表位是表達在pⅢ蛋白的N-末端［16］，而PⅧ噬菌體展示載體表達的多肽在其N-末端會有部分前導肽表達。因此，在模擬表位前設計一腸激酶酶切位點（DDDDK），在表達后應用腸激酶酶切，可使模擬表位表達在pⅧ蛋白的N-末端。其對應堿基序列為：GACGACGACGACAAG，加上EcoR I和BamH I酶切位點接頭，因此設計：

T1：5'- AATTCGACGACGACGACAAGGATGCT GTCATCCTGTTGATG-3'，

T2：5'- GATCCATCAACAGGATGACAGCATCCT TGTCGTCGTCGTCG-3'。

將T1和T2加ddH2O分別配成20 nmol/mL 的寡聚核苷酸單鏈溶液，各取10 μL，混勻后置于PCR儀，99℃保溫5 min后緩慢降至室溫，-20℃保存。pC89S4噬菌粒5 μL，加入ddH2O 11 μL，酶切緩沖液2 μL，EcoR I和BamH I各1 μL，混勻后37℃雙酶切2 h，按照PCR純化試劑盒所述步驟純化酶切產(chǎn)物。退火寡聚核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物在T4DNA 連接酶作用下16℃連接8 h，乙醇沉淀法純化。連接液全量電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞，加入SOC培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)1.5 h后涂布含50 μg/mL 氨芐青霉素的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落用于擴增細胞，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒依次用Xba I、EcoR I和BamH I進行單酶切，時間2 h，之后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳觀察。酶切驗證為陽性的質(zhì)粒采用M13-40引物測序。

1.2.2 敏感宿主菌的制備及輔助噬菌體的擴增

（1）將TG1接種至2 mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)活化2次。活化后的菌液接種至加富M9培養(yǎng)基平板，37℃培養(yǎng)過夜。第2天于加富M9平板上挑取10個單菌落分別接種至2 mL LB（含40 μg/mL 四環(huán)素）中，培養(yǎng)至對數(shù)期。經(jīng)過適度稀釋的KM13噬菌體原液與對數(shù)期的TG1菌液混合，37℃靜置水浴20 min后與頂層瓊脂混勻，將頂層瓊脂傾倒于LB平板，37℃培養(yǎng)過夜，觀察噬菌斑，鑒定細菌對KM13噬菌體的敏感性。

（2）選擇對KM13噬菌體敏感的細菌制備鋪平板細菌。將敏感菌劃線接種加富M9平板，37℃培養(yǎng)過夜。第2天挑取單菌落接種2 mL LB（含有終濃度40 μg/mL 四環(huán)素），37℃，220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)早期。準備KM13噬菌體10-1至10-12稀釋度的LB懸液，取10-8至10-12稀釋度各10 μL與鋪平板細菌混合均勻，37℃靜置水浴20 min后與45℃溫育的頂層瓊脂快速混合倒于LB平板，37℃培養(yǎng)過夜。

（3）挑取一個完整噬菌斑接種至對數(shù)期的2 mL TG1菌液中，37℃，220 r/min培養(yǎng)1 h后將菌液轉(zhuǎn)入20 mL LB（含40 μg/mL 四環(huán)素，40 μg/mL卡那霉素），37℃，220 r/min培養(yǎng)過夜。

1.2.3 輔助噬菌體提取純化及滴度測定 過夜培養(yǎng)的菌液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4℃，5 000 r/min，20 min離心去除細菌，上清加入總體積1/6的20% PEG8000，2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。再4℃，10 000 r/min，20 min棄上清，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH7.5）溶解后加入總體積1/6的20% PEG80-00，2.5 mol/L NaCl溶液，冰浴1 h。4℃，10 000 r/min，20 min棄上清，沉淀用2 mL 50 mmol/L TBS（pH7.5）溶解后4℃，10 000 r/min，5 min，收集上清液。

用LB培養(yǎng)基將收集到的上清液按梯度稀釋為10-1-10-11，每個稀釋度做3個重復。按照1.2.2的方法進行噬菌斑的計數(shù)，計算公式：

PFU（mL）=（噬菌斑數(shù)/接種噬菌體積） ×（1/噬菌體稀釋度）

1.2.4 輔助噬菌體超感染及噬菌體展示模擬表位的提取純化 將經(jīng)測序鑒定成功的工程菌pC89-ekzen劃線于LB平板（含50 μg/mL 氨芐青霉素，40 μg/mL 四環(huán)素），37℃培養(yǎng)過夜。第2天挑取取單菌落接種至20 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)早期。通常OD600=2.0時，細菌密度約為1.6×109細胞/mL［17］。取1 mL菌液，按照感染復數(shù)為40加入已測定滴度的噬菌體后混勻［18］，37℃靜置20 min超感染；超感染后的菌液轉(zhuǎn)入至60 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期；再加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）繼續(xù)24℃，220 r/min誘導表達［19］。

1.2.5 噬菌體展示模擬表位高效表達的ELISA檢測 將提取純化的表位噬菌體用50 mmol/L TBS（pH7.5）稀釋至A280=0.3，稀釋后的噬菌體每100 μL加入1 μL腸激酶，22℃，酶切16 h。酶切后的噬菌體用0.01 mol/L的PBS進行適當稀釋，連接有BSA的5 μg/mL人工抗原ZEN-BSA作為陽性對照，0.01 mol/L的PBS作為陰性對照，每孔包被100 μL，37℃孵育2 h；以PBS-T20為清洗液，洗板機洗板3次，5%脫脂乳37℃下封閉1 h；PBS-T20洗板4次，每孔加入1：10 000的ZEN抗體100 μL，37℃孵育45 min；然后PBS-T20洗板4次，加入1∶3 000的辣根過氧化物酶標記的二抗100 μL，37℃孵育45 min；接著用PBS-T20洗板5次，TMB顯色液顯色10 min后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應，酶標儀測定450 nm處吸光值。

1.2.6 噬菌體展示模擬表位的表達優(yōu)化

1.2.6.1超感染時菌體濃度OD600的優(yōu)化 待菌體OD600分別達到0.2、0.4、0.6、0.8后加入感染復數(shù)為40的輔助噬菌體超感染，超感染后的菌液轉(zhuǎn)入至60 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，24℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測 。

1.2.6.2 加入IPTG誘導時菌體濃度OD600的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時加入感染復數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，待菌體OD600分別達到0.2、0.4、0.6、0.8時，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L ，24℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

1.2.6.3 IPTG終濃度的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時加入感染復數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L，24℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

1.2.6.4 表達溫度的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時加入感染復數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，分別于24℃和37℃進行誘導表達8 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

1.2.6.5 誘導表達時間的優(yōu)化 菌體OD600為0.4時加入感染復數(shù)為40的KM13超感染，超感染后的菌體加入至60 mL培養(yǎng)基，37℃，220 r/min培養(yǎng)至OD600為0.6，再加入IPTG至終濃度為1.0 mmol/L，于24℃進行誘導表達4、6、8、10 h，提取純化的表位噬菌體進行ELISA檢測。

2 結(jié)果

2.1 ZEN-PⅧ噬菌體展示載體的構(gòu)建

退火寡聚核苷酸鏈與質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物連接純化后，電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌XL1-Blue感受態(tài)細胞。從單菌落擴增出來的細胞中提取重組質(zhì)粒后，用Xba I、EcoR I和BamH I進行單酶切。pC89S4具有兩個Xba I酶切位點，相距147 bp，經(jīng)Xba I酶切后能產(chǎn)生兩段大小不同的片段。但重組質(zhì)粒中插入的目的片段取代了一個Xba I酶切位點，因此3種酶都只有一個酶切位點。由圖1可知，重組質(zhì)粒經(jīng)過Xba I、EcoR I和BamH I酶切之后都能得到同等大小的單一條帶，說明質(zhì)?？赡苁侵亟M質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)過測序，結(jié)果顯示其序列與預期一致，證明表達載體pC89-CZEN構(gòu)建成功，如圖2。

2.2 輔助噬菌體滴度測定

經(jīng)平板計數(shù)，稀釋度為10-8時噬菌斑平均大于300個，10-9時平均為67個，10-10時平均為8個，因此選取稀釋度為10-9進行計算：

KM13滴度= （噬菌斑數(shù)/接種噬菌體體積）× （1/噬 菌 體 稀 釋 度） = （67/0.01） × （1/10-9） =6.7×1012/mL

2.3 噬菌體展示模擬表位的表達優(yōu)化

2.3.1 超感染時菌體濃度OD600的優(yōu)化 由圖3可知，當菌體濃度OD600為0.4時進行超感染，提取的ZEN模擬表位肽與抗體結(jié)合后的A450值最高。

2.3.2 加入IPTG誘導時菌體濃度OD600的優(yōu)化 由圖4可知，加入IPTG誘導表達的效果隨菌體濃度的上升有所增加，但不是很明顯，至OD600為0.6時最高，隨后降低。

2.3.3 IPTG終濃度的優(yōu)化 由圖5可知，隨著IPTG終濃度的提高，A450也隨之提高，但不是很明顯。當終濃度為1.5 mmol/L時，A450下降較快，是由于IPTG 對細胞存在毒性，濃度過高時會抑制細菌的生長。

2.3.4 表達溫度的優(yōu)化 由圖6可知，雖然37℃為大腸桿菌的最適生長溫度，但在此溫度下表達的模擬表位與抗體的結(jié)合效果卻不如24℃，說明在24℃時更利于模擬表位的表達。

2.3.5 誘導表達時間的優(yōu)化 由圖7可知，隨著誘導表達時間的延長，結(jié)合效率不斷提高，到8 h后基本不變，出于節(jié)約時間成本的目的，選擇誘導為8 h。

2.4 腸激酶酶切對抗體結(jié)合效果的影響

純化后的噬菌體展示模擬表位經(jīng)酶切后與未酶切的同樣進行ELISA測定。經(jīng)酶切與未酶切的噬菌體展示模擬表位與抗體的結(jié)合結(jié)果比較如圖8。從圖8可以看出，酶切后的結(jié)合效果明顯高于酶切前。

3 討論

本試驗采用的是絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，在絲狀噬菌體展示系統(tǒng)中，主要的展示蛋白是pⅧ和pⅢ蛋白。用于絲狀噬菌體展示的載體主要有噬菌體載體和噬菌粒載體。噬菌粒是帶有絲狀噬菌體復制起點的質(zhì)粒。pC89S4就是在具有ColE1復制起點及氨芐青霉素抗性選擇標記的質(zhì)粒上再加上單拷貝的絲狀噬菌體主要基因間隔區(qū)?？寺∮趐C89S4內(nèi)的T1T2片段，可以像質(zhì)粒一樣用常規(guī)方法進行增殖。而當帶有重組質(zhì)粒的XL1-Blue被KM13輔助噬菌體超感染后，在病毒的基因Ⅱ蛋白影響下，質(zhì)粒的復制方式發(fā)生改變?；颌虍a(chǎn)物與質(zhì)粒所攜帶的基因間隔區(qū)相互作用，啟動滾換復制，以產(chǎn)生質(zhì)粒DNA一條鏈的拷貝。這些質(zhì)粒DNA的單鏈拷貝經(jīng)切割產(chǎn)生切口，然后環(huán)化，最后被包裝進子代噬菌體顆粒中，進而將目的多肽展示在噬菌體表面。

本研究在成功構(gòu)建pC89-CZEN噬菌粒載體的基礎上，對3個表達條件進行了優(yōu)化。發(fā)現(xiàn)菌體處于對數(shù)前期時，更利于輔助噬菌體的吸附侵染。IPTG是一種十分有效的乳糖操縱子的誘導劑，可與阻遏蛋白結(jié)合成復合物，而使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，阻遏蛋白就不能結(jié)合到大腸桿菌中的Lac 啟動子上，從而使乳糖操縱子能夠被轉(zhuǎn)錄，誘導蛋白的表達。IPTG誘導的效果與菌體的狀體和自身的濃度有很大關系。在對數(shù)期時，生長代謝旺盛，對一切誘導藥物和環(huán)境因素的作用最為敏感，若加入時間過早，可能會抑制宿主菌的生長，加入太遲，菌體已成熟，菌體內(nèi)各種酶的合成能力降低，表達量也減少［20］。IPTG的使用量也有要求，IPTG 具有細胞毒性，濃度過高時會抑制細菌的生長，進而降低蛋白的表達。在進行低溫24℃表達時，更有利于融合蛋白的可溶性蛋白表達及向胞外分泌，37℃時更多地以包涵體的方式表達。誘導表達8 h后，噬菌體量達最大，對應的模擬表位肽的量也達到最大，時間再延長基本不變。

pC89S4所表達的外源片段其N-末端殘留有5肽。本實驗室在研究中發(fā)現(xiàn)ZEN模擬表位N-末端的5肽影響了ZEN抗體與模擬表位的結(jié)合。為解決這一問題，在ZEN模擬表位5'端引入了腸激酶酶切位點，構(gòu)建出噬菌粒pC89-CZEN。腸激酶可沿序列的羧基端切下。成熟的ZEN模擬表位-pⅧ融合蛋白經(jīng)腸激酶酶切后，ZEN模擬表位暴露出來，提高了與抗體的結(jié)合幾率，為后續(xù)建立無毒ELISA方法檢測真菌毒素打下了基礎。

4 結(jié)論

本試驗成功構(gòu)建了噬菌粒pC89-CZEN，利用此載體實現(xiàn)了ZEN模擬表位在噬菌體表面的成功展示。展示有ZEN模擬表的噬菌體純化方法簡單。ELISA檢測證實ZEN模擬表位-pⅧ融合蛋白具有良好的反應原性。

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