劉春 曹麗敏 李玉中 彭晚霞 麻浩

（1.衡陽師范學(xué)院，衡陽 421008；2.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，長沙 410125；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210095）

非生物脅迫貽誤植物生長和生產(chǎn)率并且引發(fā)一系列形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、生物化學(xué)和分子方面的變化。干旱、極端溫度和鹽堿化土壤是植物遇到的最常見的非生物脅迫。全球約有22%的農(nóng)業(yè)土壤鹽堿化［1］，干旱土壤面積已經(jīng)擴(kuò)大并且未來將進(jìn)一步擴(kuò)大。常見作物暴露在多種脅迫下，其感受和響應(yīng)不同環(huán)境因子的方式可能是重疊的。干旱或鹽分脅迫下大麥植株的基因表達(dá)譜表明，雖然在響應(yīng)不同脅迫方面各種基因是差異化調(diào)控的，但它們可能誘導(dǎo)一種類似的防御反應(yīng)［2］。

當(dāng)植物遭遇非生物脅迫時(shí)，一系列基因被誘導(dǎo)，導(dǎo)致一些代謝物和蛋白質(zhì)含量水平的增加，其中一些可能響應(yīng)這些非生物脅迫從而起到某種程度的保護(hù)作用。與脅迫耐受性相關(guān)的常規(guī)育種常常從供體親本帶來不理想的農(nóng)藝性狀。因此，通過導(dǎo)入和/或過表達(dá)被選基因的基因工程植物的發(fā)展可能是促進(jìn)改良植物育種的可行選擇。同時(shí)，當(dāng)有益基因源自有雜交障礙的物種、遠(yuǎn)親或非植物生物時(shí)基因工程將是唯一的選擇。實(shí)際上，已在轉(zhuǎn)基因植株中測試了多種與抗性相關(guān)的性狀，而且各種轉(zhuǎn)基因技術(shù)已被用來提高植物的脅迫耐受性［3］。

如何評估轉(zhuǎn)基因植株的安全性，以及如何將模式植物中的基因效應(yīng)應(yīng)用到作物品種中去是很重要的。但目前涉及非生物脅迫轉(zhuǎn)基因植物評估的大量文獻(xiàn)表明，試驗(yàn)室條件下的轉(zhuǎn)基因效應(yīng)不太可能在自然條件下發(fā)生。因此，這里需要一套對轉(zhuǎn)基因植株響應(yīng)大田環(huán)境下非生物脅迫進(jìn)行嚴(yán)格評估的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。因?yàn)槠褚淹度氲墓ぷ鞔蟛糠謨H集中在少數(shù)模式植物上。

本文總結(jié)了在干旱、鹽分和低溫脅迫方面利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)增強(qiáng)非生物脅迫耐受性的研究進(jìn)展，以及如何對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行評估。

1 單結(jié)構(gòu)基因

1.1 滲透保護(hù)劑基因

嚴(yán)重的滲透脅迫是細(xì)胞成分有害變化的原因。迄今已在脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植株中應(yīng)用了在滲透調(diào)節(jié)期間積累的與滲透保護(hù)劑合成有關(guān)的許多基因［4］。在耐逆境生物中特殊滲透保護(hù)劑是自然積累的，但許多作物缺少合成特殊滲透保護(hù)劑的能力。如果在干旱、鹽分和高溫響應(yīng)中滲透調(diào)節(jié)基因可以引發(fā)，那么滲透調(diào)節(jié)是植物非生物脅迫耐受性的一個(gè)好策略。因此，已經(jīng)用來設(shè)計(jì)某些滲透因子或通過在植物中過表達(dá)這些滲透因子，作為耐逆境作物育種的一個(gè)潛在路線。該路線的第一步已通過編碼滲透因子合成酶的基因工程獲得耐逆轉(zhuǎn)基因植株［5］。已有如甘氨酸-甜菜堿［6］和脯氨酸［7］等滲透保護(hù)劑應(yīng)用的報(bào)道。同樣，一些糖醇已作為過量產(chǎn)生相容性溶質(zhì)的基因工程的目標(biāo)，從而在脅迫期間保護(hù)細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)復(fù)合物［8］。類似的，過量表達(dá)多胺的基因工程也已發(fā)展［9］。鑒定、分離、克隆與提高洪水脅迫耐受性的相關(guān)基因的研究集中于糖酵解和乙醇發(fā)酵途徑的酶類，該途徑揭示在缺氧脅迫響應(yīng)中呼吸鏈?zhǔn)鞘苡绊懙闹饕緩?。對煙草和水稻中丙酮酸脫羧酶（pdc）和乙醇脫氫酶（adh）基因水平的改變進(jìn)行了研究，以便闡明其在水淹耐受性中的作用。過表達(dá)和低表達(dá)pdc1基因的轉(zhuǎn)基因水稻也得到發(fā)展，并顯示出在水淹后的生存率與高PDC的活性正相關(guān)［10］。

在上述的大部分例子中，生物合成和代謝途徑的轉(zhuǎn)基因修飾結(jié)果揭示了脅迫耐受性的提高和相容性溶質(zhì)的積累也可能通過清除活性氧（ROS）以及在維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能中通過其活化類分子伴侶來實(shí)現(xiàn)［11］。然而，觀察到初級代謝的內(nèi)生途徑紊亂導(dǎo)致的多種有害效應(yīng)，如細(xì)胞壞死和生長遲緩。同樣，在滲透脅迫對產(chǎn)量潛能的負(fù)效應(yīng)方面也有一些報(bào)道［12］。相容性溶質(zhì)的基因操作并非總是導(dǎo)致化合物的顯著積累，表明相容性溶質(zhì)的功能不限于滲透調(diào)節(jié)，而且滲透保護(hù)劑可能并非總能提高干旱耐受性。利用鷹嘴豆的一項(xiàng)研究顯示在干旱脅迫下滲透調(diào)節(jié)不能對產(chǎn)量產(chǎn)生有益的影響［13］。

1.2 解毒基因

在大多數(shù)好氧生物中，需要有效消除由環(huán)境脅迫而產(chǎn)生的ROS。根據(jù)ROS的性質(zhì)，一些高毒性的需要立即解毒。為了控制ROS的水平和保護(hù)細(xì)胞免受氧化傷害，植物已進(jìn)化出一套復(fù)雜的抗氧化防御系統(tǒng)以清除ROS。抗氧化系統(tǒng)包括可能在植物ROS信號中起了重要作用的各種酶類和非酶類代謝物［14］。通過解毒策略獲得增強(qiáng)了非生物脅迫耐受性的一些轉(zhuǎn)基因植物，包括過表達(dá)諸如谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）、過氧化物歧化酶（SOD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、谷胱甘肽還原酶（GR）等與氧化保護(hù)有關(guān)的酶類的轉(zhuǎn)基因植物［15］。過表達(dá)葉綠體Cu/Zn SOD的轉(zhuǎn)基因煙草［16］和馬鈴薯植株［17］在低溫脅迫下光合性能急劇改善。過表達(dá)Mn SOD的轉(zhuǎn)基因煙草植株只有在其他抗氧化酶類和底物存在時(shí)才能增強(qiáng)其對氧化脅迫的耐受性，表明基因型和同工酶的組成對轉(zhuǎn)基因植株對非生物脅迫耐受性也有深刻的影響［18］。在葉綠體中過表達(dá)Mn SOD的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿（Medicago sativa）植株顯示能降低膜損傷［19］，轉(zhuǎn)基因煙草植株過量產(chǎn)生紫花苜蓿醛糖還原酶基因（MsALR）顯示能降低活性醛類的濃度和增強(qiáng)對氧化劑和干旱脅迫的耐受性［20］。

1.3 胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白

胚胎發(fā)生晚期豐富蛋白（LEA）代表另一類高分子量蛋白質(zhì)，該類蛋白質(zhì)在胚胎發(fā)生晚期豐富，并在種子脫水期和對水分脅迫的響應(yīng)中積累。在幾組LEA蛋白中，屬于第3組的被預(yù)測在隔離離子方面起作用，該組蛋白質(zhì)具有11個(gè)串聯(lián)重復(fù)的氨基酸模序，該模序具有重復(fù)多達(dá)13次的保守序列TAQAAKEKAGE［21］。第1組LEA蛋白被推測具有增強(qiáng)水分結(jié)合的能力，第5組LEA蛋白被認(rèn)為在水分喪失時(shí)隔離離子。組成型過表達(dá)來自大麥的一個(gè)第3組LEA蛋白質(zhì)HVA1賦予轉(zhuǎn)基因水稻植株脫水和鹽分脅迫耐受性［22］。盡管與先前報(bào)道的小麥栽培種、轉(zhuǎn)基因水稻（TNG67）植株表達(dá)小麥LEA2蛋白（PMA80）基因或小麥LEA1蛋白（PMA1959）基因?qū)е旅撍望}分脅迫耐受性增加的數(shù)據(jù)相比，上述報(bào)道的水分利用率（WUE）極低［23］，但在鹽分和水分脅迫條件下小麥和水稻的細(xì)胞完整性方面，組成型或脅迫誘導(dǎo)表達(dá)HVA1基因?qū)е旅{迫耐受性的增強(qiáng)和生長特征的改善［24］。

1.4 轉(zhuǎn)運(yùn)體基因

取得非生物脅迫高耐受性的一個(gè)重要策略是幫助植物在脅迫條件下恢復(fù)離子和滲透的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。這是利用基因工程提高植物鹽分耐受性的一個(gè)主要途徑，該途徑的目標(biāo)是將Na+排出根部，或貯存在液泡里。通過加強(qiáng)控制轉(zhuǎn)運(yùn)功能蛋白產(chǎn)生了許多非生物脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物。例如，在鹽分脅迫條件下表達(dá)HAL1基因的轉(zhuǎn)基因甜瓜［25］和番茄［26］植株，因其比對照植株保留更多的K+而表現(xiàn)出一定水平的鹽分耐受性。

與陽離子脫毒有關(guān)的液泡氯通道基因 AtCLCd 和與酵母 NhxI 基因同源的 AtNHXI 基因已被克隆，過表達(dá)這些基因的擬南芥植株通過Na+在液泡中的區(qū)室化而增強(qiáng)其鹽分耐受性。過表達(dá)AtNHX1 的轉(zhuǎn)基因擬南芥和番茄植株通過在液泡膜中積累充足數(shù)量的轉(zhuǎn)運(yùn)體而表現(xiàn)出持續(xù)增強(qiáng)的鹽分耐受性［27］。擬南芥中的SOS1與來自細(xì)菌和真菌質(zhì)膜中的Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)體具有相似性，已被克隆并利用CaMV 35S啟動子過表達(dá)。上調(diào)SOS1基因能提供更大的質(zhì)子動力勢，該動力勢對于提高Na+/H+反轉(zhuǎn)運(yùn)體活性是必需的［28］。

1.5 脂類生物合成基因

對于轉(zhuǎn)基因途徑，人們也計(jì)劃通過改變膜的脂類生化性質(zhì)來增強(qiáng)非生物脅迫條件下的光合作用?；罴?xì)胞對低溫的適應(yīng)性是通過增加脂肪酸的不飽和性導(dǎo)致膜脂組成改變而實(shí)現(xiàn)。過表達(dá)來自西葫蘆（Cucurbita maxima）和擬南芥［29］的葉綠體丙三醇-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（GPAT）基因（涉及磷脂酰丙三醇脂肪酸去飽和）的基因工程煙草植株，因增加了一些不飽和脂肪酸而相應(yīng)地降低了對其低溫的敏感性。此外，沉默表達(dá)葉綠體ω3-脂肪酸去飽和酶（Fad7，合成三烯脂肪酸）的轉(zhuǎn)基因煙草植株與野生型相比能適應(yīng)高溫［30］。

1.6 熱激蛋白基因

熱休克反應(yīng)能增加響應(yīng)熱或其他毒劑的一套基因的轉(zhuǎn)錄，是一個(gè)高度保守的生物學(xué)反應(yīng)，發(fā)生在所有生物體中［31］。該反應(yīng)受熱激轉(zhuǎn)錄因子（HSF）的介導(dǎo)，該轉(zhuǎn)錄因子在無脅迫細(xì)胞中以單體的、非DNA結(jié)合的形式存在，在脅迫下被激活成能結(jié)合熱激基因啟動子的三聚體形式。熱激蛋白（Hsps）編碼基因的誘導(dǎo)是生物體暴露在高溫下時(shí)，在分子水平被觀察到的一個(gè)非常突出的反應(yīng)［32］。

在植物中通過增加熱激蛋白的合成提高耐熱性的基因工程已成功獲得許多轉(zhuǎn)基因植物［33］。盡管利用這些熱激蛋白賦予植物脅迫耐受性的精確機(jī)理未知，但最近的研究證明，在體內(nèi)能被組裝成功能性脅迫顆粒（HSGs）而獲得熱保護(hù)功能［34］。

2 調(diào)控基因

為了修復(fù)細(xì)胞功能使植物對脅迫更有耐性，轉(zhuǎn)移編碼單個(gè)特異脅迫蛋白的基因可能是不夠的。為了克服這些不足，利用一個(gè)基因編碼一個(gè)調(diào)節(jié)許多其他基因的脅迫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，從而增強(qiáng)面向多種脅迫的耐受性是一個(gè)有希望的途徑［35］。因此，最近作物基因工程偏愛的第二類基因是那些開啟調(diào)節(jié)與非生物脅迫相關(guān)的多個(gè)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子基因。

2.1 轉(zhuǎn)錄因子

分子生物學(xué)研究表明，植物中由諸如干旱、高鹽和低溫等環(huán)境脅迫因子誘導(dǎo)的幾個(gè)基因具有多種功能。大多數(shù)干旱應(yīng)答基因是由植物激素脫落酸（ABA）誘導(dǎo)的，但也有少數(shù)基因例外。對模式植物擬南芥基因表達(dá)中的干旱應(yīng)答基因的分析表明，至少存在4個(gè)獨(dú)立調(diào)節(jié)系統(tǒng)。對典型脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的一些基因中啟動子的順勢作用元件和影響這些基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄子也進(jìn)行了分析。分離出與脫水響應(yīng)元件/C重復(fù)序列（DRE /CRT）順勢作用元件結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，并命名為DRE 結(jié)合蛋白1/C重復(fù)序列結(jié)合因子（DREB1/ CBF）和DRE結(jié)合蛋白2（DREB2）。在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，DREB1/CBF 過量表達(dá)可增加其抗寒、抗旱和抗鹽堿的能力。DREB1/CBF 基因成功地在許多不同作物中得到應(yīng)用，從而提高作物對非生物脅迫的耐受性。對與脅迫反應(yīng)相關(guān)的其他轉(zhuǎn)錄因子的研究也取得了進(jìn)展。有關(guān)這方面的內(nèi)容，已有不少綜述［36-38］。

2.2 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因

植物為適應(yīng)各種外界環(huán)境刺激，以最大限度地減少逆境對自身的傷害，在長期的進(jìn)化過程中，從對逆境信號的感知、胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和傳遞，到最終表達(dá)各種逆境基因，產(chǎn)生適應(yīng)性，形成了一系列復(fù)雜的逆境信號傳遞的分子機(jī)制。雖然在細(xì)胞水平的基因調(diào)節(jié)存在多途徑信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，但同一信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑組分可能被干旱、鹽分和寒冷等各種脅迫因子分享［39］。ABA是在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起作用的已知成分之一，ABA信號途徑的主要負(fù)調(diào)控因子——蛋白磷酸酶2C（PP2C）是一類絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶（PSP），為ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑下游的關(guān)鍵組分。擬南芥中PP2C主要包括ABI1、ABI2、HAB1、AHG3和PP2CA，它們通過改變ABA信號的強(qiáng)弱等調(diào)控植物的脅迫應(yīng)答［40］。促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)途徑信號通路在真核生物細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)換和放大過程中起重要作用。MAPK 級聯(lián)途徑由3個(gè)成員組成，分別是MAPK、MAPKK 及MAPKKK，這3個(gè)信號組分按照MAPKKK-MAPKK-MAPK 的方式依次磷酸化將外源信號級聯(lián)放大向下傳遞。大量研究表明，植物MAPK 級聯(lián)途徑參與調(diào)控脫落酸（ABA）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［41］。Ca2+作為植物細(xì)胞中最重要的第二信使，參與植物對許多逆境信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)。在非生物逆境條件下，植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Ca2+在時(shí)間、空間及濃度上會出現(xiàn)特異性變化，即誘發(fā)產(chǎn)生鈣信號。鈣信號再通過其下游的鈣結(jié)合蛋白進(jìn)行感受和轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而在細(xì)胞內(nèi)引起一系列的生物化學(xué)反應(yīng)以適應(yīng)或抵制各種逆境脅迫。目前，在植物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)Ca2+/CDPK、Ca2+/ CaM和Ca2+/CBL 3類鈣信號系統(tǒng)，研究表明它們與非生物逆境脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)［42］。

操縱信號因子的優(yōu)點(diǎn)之一是它們可以控制許多的下游事件，這些事件可導(dǎo)致在多方面超級耐性。改變這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)成分是降低細(xì)胞對脅迫環(huán)境敏感的途徑。在擬南芥植株中過表達(dá)功能性保守的At-DBF2（酵母DBf2激酶同系物）表現(xiàn)出顯著的多脅迫耐受性［43］。Pardo等［44］通過過表達(dá)鈣調(diào)磷酸酶也獲得了鹽分脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植株。在擬南芥中過表達(dá)一個(gè)滲透脅迫活化蛋白激酶——SRK2C，導(dǎo)致較高的干旱耐受性，這與脅迫響應(yīng)基因的上調(diào)相一致。類似的，煙草MAPKKK、NPK1在玉米中激活了一個(gè)氧化信號級聯(lián)使轉(zhuǎn)基因植株具寒冷、熱、鹽分和干旱耐受性［45］。然而，信號因子的抑制也可有效增強(qiáng)植物對非生物脅迫的耐受性［46］。這個(gè)假設(shè)是基于先前的報(bào)道揭示的法昵基轉(zhuǎn)移酶ERA1的a亞基和b亞基行使ABA信號負(fù)調(diào)節(jié)子的功能［47］。條件反義下調(diào)法昵基轉(zhuǎn)移酶a和b亞基導(dǎo)致增強(qiáng)了擬南芥和canola油菜植株的干旱耐受性。

3 啟動子的選擇

轉(zhuǎn)基因技術(shù)的一個(gè)重要方面是轉(zhuǎn)基因的表達(dá)調(diào)控。當(dāng)決定選擇啟動子以便增加基因的表達(dá)水平時(shí)，轉(zhuǎn)基因的組織特異性表達(dá)也是一個(gè)重要的考量。因此，啟動子的類型和啟動子的強(qiáng)度對于調(diào)整植物對脅迫的響應(yīng)是很關(guān)鍵的。一些基因的產(chǎn)物是大量的，如LEA3，從而需要一個(gè)很強(qiáng)的啟動子。而有些基因產(chǎn)物，如多胺生物合成需要的酶，最好使用一個(gè)中等強(qiáng)度的誘導(dǎo)型啟動子。迄今在產(chǎn)生非生物脅迫耐受性植物方面最常用的啟動子包括CaMV 35S、泛素1和肌動蛋白啟動子。這些啟動子在自然界是組成型的，通過它們使轉(zhuǎn)入的基因及其下游在所有器官和階段大量表達(dá)。但諸如海藻糖［48］或多胺［49］等分子的組成型過量產(chǎn)生會導(dǎo)致在正常生長條件下植株的異常。且上述分子的產(chǎn)生也是昂貴的代謝。在這種情況下，利用脅迫誘導(dǎo)型啟動子更合適。在植物中，各種非生物脅迫誘導(dǎo)許多被很好描述的有用啟動子。一個(gè)理想的誘導(dǎo)型啟動子不僅應(yīng)該在缺乏誘導(dǎo)劑時(shí)無任何本底水平的基因表達(dá)，而且表達(dá)應(yīng)是劑量依賴性的和可逆的。為了鑒定出與被非生物脅迫誘導(dǎo)的基因表達(dá)有關(guān)的幾種順式作用和反式作用元件，分析了干旱誘導(dǎo)和寒冷誘導(dǎo)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域［50］。大部分脅迫誘導(dǎo)型啟動子包含一個(gè)脅迫特異性順式作用元件，該元件被必需轉(zhuǎn)錄因子識別。例如，hsp基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是受定位于這些基因啟動子區(qū)域5’ TATA box的核心熱激元件（HSE）介導(dǎo)的。目前所有植物的hsp基因序列顯示，在TATA基序鄰近區(qū)域含有多個(gè)部分重疊的HSEs。除了這些hsp啟動子，也有人在研究受滲透脅迫和缺氧脅迫誘導(dǎo)的rd29和adh基因啟動子。擬南芥rd29A和rd29B是脅迫響應(yīng)基因，脫水、高鹽和低溫誘導(dǎo)基因的rd29A啟動子包括DRE 和ABRE兩個(gè)元件，而rd29B啟動子只包括ABREs，并且是依賴ABA誘導(dǎo)的。過表達(dá)來自rd29A脅迫誘導(dǎo)型啟動子控制下的DREB1A轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)基因植株，比利用獲得組成型CaMV 35S啟動子的植株表現(xiàn)出更好的表型生長［51］。Lee［52］利用來自大麥HAV22的ABRC1啟動子在轉(zhuǎn)基因番茄中獲得一個(gè)脅迫誘導(dǎo)表達(dá)的擬南芥CBF1?；虮磉_(dá)是受DREB1A誘導(dǎo)的，DREB1A是受寒冷和水分脅迫誘導(dǎo)的，在rd29A、rd17、cor6.6、cor15A、erd10等基因的啟動子中的一個(gè)順式作用DRE元件，因此，基因產(chǎn)物的合成賦予植物低溫和水分脅迫耐受性。玉米和水稻中呼吸鏈adh1基因啟動子區(qū)域包含一個(gè)缺氧響應(yīng)元件（ARE），缺氧響應(yīng)元件（ARE）具有TGGTTT的核心元件保守序列。此外，已在如Cor 6.6、Cor 15 和 Cor 78基因中鑒定出其他的脅迫響應(yīng)順式作用啟動子序列，如具有A/GCCGAC保守序列的低溫響應(yīng)元件（LTRD）。在脅迫誘導(dǎo)型啟動子方面的這些發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致基因工程化脅迫耐受性作物范式的重要轉(zhuǎn)變［53］。

4 脅迫效應(yīng)的生理評價(jià)

許多研究在不同的植物中評估了響應(yīng)，諸如干旱、鹽分和寒冷等不同脅迫的轉(zhuǎn)基因效應(yīng)。但用于評估脅迫響應(yīng)的方法卻鮮有詳細(xì)信息。因此，在接下來的討論中，我們將專注于農(nóng)藝/生理視角的評估，但不意味著挑戰(zhàn)在基因表達(dá)評估方面所做的大量工作。我們的目的是嘗試協(xié)調(diào)分子和農(nóng)藝兩種途徑朝向一個(gè)方向：育種。在轉(zhuǎn)基因的脅迫響應(yīng)評估方面有兩個(gè)主要的議題需要強(qiáng)調(diào)：（1）強(qiáng)加的脅迫方式，有關(guān)脅迫的詳細(xì)信息和生長條件；（2）支持結(jié)論的測試材料在響應(yīng)方面的數(shù)據(jù)。

4.1 脅迫方式、生長環(huán)境和評價(jià)

迄今，在大部分報(bào)道中用于評估轉(zhuǎn)基因材料的脅迫條件常常太嚴(yán)峻［54］。例如，Pellegrineschi 等［55］通過持續(xù)10 d不給盆栽的兩周齡小麥苗澆水，而后復(fù)水直至成熟，比較了轉(zhuǎn)DREB1A基因小麥與野生親本的表現(xiàn)。未轉(zhuǎn)化的植株在強(qiáng)加脅迫10-15 d內(nèi)幾乎全部死亡，但轉(zhuǎn)基因植株存活下來，這樣的脅迫條件在大田環(huán)境下可能不會發(fā)生。Pilon-Smits等［56］報(bào)道在水培中利用聚乙二醇（PEG）可以有效的測試植物在給定的滲透勢下的某些反應(yīng)，與在土壤中的環(huán)境相比，水培提供了相對不同的條件，水培溶液成分是有限且明確的。在這里，觀察到的生長改良被解釋為轉(zhuǎn)基因植株的滲透劑的產(chǎn)生。因?yàn)樵谒鄺l件下水容量是無限的且水勢恒定，在該系統(tǒng)中這種情況有發(fā)生的可能。然而，在土壤環(huán)境中，根周圍土壤中供利用的水分體積是有限的，當(dāng)水分被根攝取后土壤中水勢會迅速下降，甚至轉(zhuǎn)基因增強(qiáng)滲透劑產(chǎn)物可能不能攝取更多的水分。利用滲透勢增強(qiáng)型轉(zhuǎn)基因的一個(gè)更現(xiàn)實(shí)的水分?jǐn)z取能力測試是比較它們從土壤系統(tǒng)中攝取水分的能力。Sivamani等［57］報(bào)道了在轉(zhuǎn)基因小麥中WUE的增加，不幸的是報(bào)道中沒有土壤蒸發(fā)的對照，而土壤蒸發(fā)是大部分水分喪失和觀察到非常低的WUE的原因。此外，利用鮮重和生長率、莖的生長［52］或存活下來［44］等其他表現(xiàn)來間接評估很可能得出不一致的結(jié)果。因此，當(dāng)實(shí)施干旱脅迫時(shí)，應(yīng)對有關(guān)生長環(huán)境、植株大小、容器型號、水分供給和蒸騰作用等做詳盡的描述。

4.2 應(yīng)用于干旱和鹽分脅迫的多種方案

在做轉(zhuǎn)基因評估時(shí)，干旱脅迫的實(shí)施不是簡單的截留水分。實(shí)際上，如果不了解植物在自然環(huán)境中對干旱響應(yīng)的不同階段，我們就不能洞察植物的干旱響應(yīng)機(jī)理。這些階段已在早先進(jìn)行了描述［58，59］（圖1）。在階段I，水分豐富，植物可通過氣孔全開放的蒸騰作用攝取全部所需水分。在此階段，水分喪失主要決定于葉子所處的環(huán)境條件。階段II期間，根不再能夠給莖提供充足的水分，氣孔逐漸關(guān)閉以調(diào)節(jié)水分供給和喪失之間的平衡，從而維持葉片的膨壓。在階段III，根已經(jīng)耗盡所有可供蒸騰作用的水分。氣孔關(guān)閉、包括光合作用在內(nèi)的幾乎所有有助于生長的生理過程均被抑制。該過程常用于設(shè)計(jì)脫水試驗(yàn)，在試驗(yàn)中植物對干旱的響應(yīng)是根據(jù)可供給植物的土壤水分部分（可蒸發(fā)的土壤水分部分，F(xiàn)TSW），而不是實(shí)施脅迫后的天數(shù)。這樣，允許在強(qiáng)加脅迫的試驗(yàn)和自然環(huán)境條件之間有一個(gè)精確的比較，這一方法在國際半干旱地區(qū)熱帶作物研究所（ICRISAT）成功用于評估溫室環(huán)境下14個(gè)轉(zhuǎn)受rd29A啟動子驅(qū)動的DREB1A基因花生（圖1）的響應(yīng)情況［59］。

圖1 花生品種JL 24對土壤干旱脅迫的一個(gè)典型響應(yīng)曲線［59］

關(guān)于鹽分脅迫，迄今大部分評估報(bào)道主要在苗期進(jìn)行，但鹽脅迫下植物在后期表現(xiàn)如何更值得探究。此外，評估是通過利用高濃度的鹽分在短期內(nèi)做出的，但這些發(fā)現(xiàn)甚至在高鹽自然環(huán)境中顯然放大了轉(zhuǎn)基因工程的耐鹽效應(yīng)。因此，用過高濃度的鹽分進(jìn)行評估的方法應(yīng)該避免。

我們常常假設(shè)避免Na+的積累和毒性可賦予植物鹽分耐受性。因此，大部分轉(zhuǎn)基因工作是處理涉及從根部排出Na+或?qū)a+區(qū)室化于液泡中的基因。雖然在水培條件下的嚴(yán)峻脅迫（超過200-300 mmol/L）［6，52］在自然環(huán)境中是不太可能發(fā)生的，但該試驗(yàn)中轉(zhuǎn)基因植株能排泄Na+，并能維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)。然而，Vadez等［60］報(bào)道在鷹嘴豆中鹽分耐受性與Na+的積累差異無關(guān)。因此，在鷹嘴豆中Na+的排出策略有待進(jìn)一步研究。

此外，也可根據(jù)種子產(chǎn)量對植物脅迫耐受性進(jìn)行評估，因?yàn)樯成L可能是受鹽分影響的關(guān)鍵生理階段。因此，有意增強(qiáng)鹽分耐受性的轉(zhuǎn)基因研究應(yīng)該集中于對脅迫敏感的階段。對這些過程的全面研究將有助于設(shè)計(jì)出一條更合適的轉(zhuǎn)基因途徑。

5 結(jié)論

本文總結(jié)了通過利用一些已克隆和描述的脅迫相關(guān)基因和轉(zhuǎn)錄因子來提高植物非生物脅迫耐受性的研究進(jìn)展。發(fā)展非生物脅迫耐受性轉(zhuǎn)基因植物的最初嘗試始于單結(jié)構(gòu)基因，脅迫誘導(dǎo)的已知功能蛋白質(zhì)如水分通道蛋白、參與滲透物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵酶、脫毒酶類，以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是植物轉(zhuǎn)化的最初目標(biāo)。實(shí)際上，代謝性狀，尤其是少數(shù)酶類作用途徑的遺傳特征已被闡明，并且似乎比結(jié)構(gòu)和發(fā)育性狀更易操縱。然而，該途徑被忽視的一個(gè)事實(shí)是非生物脅迫耐受性同時(shí)與許多基因有關(guān)，單個(gè)基因的耐受性是不太可能持續(xù)發(fā)展的。因此，第二階段的轉(zhuǎn)化試圖利用第三類脅迫誘導(dǎo)基因即調(diào)節(jié)蛋白來轉(zhuǎn)化植物。通過這些蛋白質(zhì)，許多與脅迫響應(yīng)相關(guān)的基因可被單個(gè)基因編碼的脅迫誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子同時(shí)調(diào)節(jié)［51］，從而增強(qiáng)對干旱、鹽分和冰凍在內(nèi)的多種脅迫的耐受性。

基因工程允許對基因進(jìn)行時(shí)間、組織特異性操作，以及發(fā)揮導(dǎo)入基因最適功能的表達(dá)水平。在產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株中最廣泛應(yīng)用的啟動子是組成型表達(dá)，然而，當(dāng)基因表達(dá)需要設(shè)計(jì)成在特異器官或特異時(shí)間表達(dá)時(shí)，這種組成型啟動子可能并非合適的選擇，尤其是對于脅迫誘導(dǎo)的基因來說。因此，最近更致力于利用脅迫誘導(dǎo)型啟動子驅(qū)動的基因來產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植株。

最后，如何對特定的非生物脅迫耐受性進(jìn)行評估，尤其是自然環(huán)境條件下的非生物脅迫耐受性的評估，以及在實(shí)驗(yàn)室條件下獲得的耐受性是否在自然條件下優(yōu)于現(xiàn)有植物本身的耐受性，都是有待進(jìn)一步解決的問題，響應(yīng)非生物脅迫的不同代謝物產(chǎn)出的生物成本及其對產(chǎn)量的影響亦需進(jìn)行正確的評估。

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