劉鐵成

(1.哈藥集團(tuán)技術(shù)中心 黑龍江哈爾濱 150012;2.哈藥集團(tuán)生物工程有限公司 黑龍江哈爾濱 150012;3.東北林業(yè)大學(xué) 黑龍江哈爾濱 150040)

氨基酸分析方法多種多樣,比較常見的方法有高效毛細(xì)管電泳法[1],串聯(lián)質(zhì)譜法[2],高效液相色譜熒光法[3],等多種方法。這其中柱前衍生氨基酸的高效液相色譜應(yīng)用最為廣泛[4]。柱前衍生很早就有報(bào)道[5]。本文采用美國沃特斯公司提供的商品化氨基酸衍生試劑盒,采用C18反相色譜柱進(jìn)行[6]。其原理就是因?yàn)槎鄶?shù)氨基酸本身沒有顯色集團(tuán),因此需要加入衍生試劑使被檢測的氨基酸能夠顯色。提高檢測靈敏度。通過高效液相色譜分離。通過標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行標(biāo)定,計(jì)算準(zhǔn)確含量。這樣的方法可以測定細(xì)胞培養(yǎng)也中流離的氨基酸含量。因此能夠反映出細(xì)胞培養(yǎng)后期,某些氨基酸是否缺失。通過對缺失氨基酸的補(bǔ)充,延長細(xì)胞培養(yǎng)周期。提高細(xì)胞分泌蛋白能力。

1 實(shí)驗(yàn)材料

圖1

圖2

表1

AccQ·Tag Chemistry Package(化學(xué)品包,P/N WAT052875)氨基酸分析試劑盒;安捷倫1200高效液相色譜;CHO細(xì)胞培養(yǎng)后期培養(yǎng)液樣品。

2 實(shí)驗(yàn)方法

(1)衍生方法如下。清潔的移液器移取10μl已稀釋的標(biāo)樣或樣品注入清潔的6×50mm衍生管(P/N WAT007571)底部。換一清潔的微量移液管頭,加70μl AccQ·Fluor 硼酸鹽緩沖液(Buffer1)到衍生管中,渦旋混合。另換一清潔的微量移液管頭吸取20μl剛剛配好的AccQ·Fluor衍生劑(2A),在渦旋狀態(tài)下加到衍生管中,并保持渦旋混和10秒鐘。在室溫下放置1分鐘。將衍生管用石蠟?zāi)し饪?放在 55℃烘箱內(nèi)加熱10分鐘。加熱后,取出,即可用于進(jìn)樣。(2)色譜條件。色譜柱:WATERS氨基酸分析柱3.9×150mm;柱溫:37℃;紫外檢測波長:254nm。

3 結(jié)果分析

通過對無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CHO細(xì)胞不同蛋白克隆表達(dá)的樣品,測定氨基酸含量變化。

氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品:(如圖1)

①無血清培養(yǎng)液;②無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CHO細(xì)胞載體后期;③無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CHO細(xì)胞表達(dá)BP326蛋白后期;④無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CHO細(xì)胞表達(dá)Erbitux蛋白后期;⑤無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CHO細(xì)胞表達(dá)Enbrel蛋白后期;⑥無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)CHO細(xì)胞表達(dá)EPO蛋白后期。根據(jù)氨基酸分析同樣用CHO細(xì)胞為載體,表達(dá)不同蛋白時細(xì)胞培養(yǎng)后期氨基酸變化情況結(jié)果分析,把取得的數(shù)據(jù)繪制成表格如下:(如圖2)

從圖表中明顯可以看出,有些氨基酸在CHO細(xì)胞培養(yǎng)后期被正常消耗,呈現(xiàn)出逐漸減少。但是同樣以CHO細(xì)胞為載體表達(dá)不同蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)后期結(jié)果并不相同。整體消耗明顯下降的有絲氨酸、組氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸。含量較高未被明顯消耗精氨酸、脯氨酸、賴氨酸。明顯增加的是丙氨酸。其他氨基酸略有消耗。

因此在進(jìn)行不同表達(dá)蛋白生產(chǎn)時細(xì)胞培養(yǎng)后期添加比例就可以根據(jù)以上事宜結(jié)果氨基酸的消耗進(jìn)行添加。設(shè)計(jì)細(xì)胞培養(yǎng)后期添加比例選取CHO-EPO為例結(jié)果如表1:

通過細(xì)胞培養(yǎng)后添加缺失的氨基酸和未添加相比,產(chǎn)量明顯提高。添加后的產(chǎn)量是未添加的1.45倍。因此,在細(xì)胞培養(yǎng)過程中尤其是細(xì)胞培養(yǎng)后期添加缺失的氨基酸可以明顯提高表達(dá)蛋白的產(chǎn)量。

[1]沈佐君,吳琳.高效毛細(xì)管電泳法快速測定血清中游離氨基酸.中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,1998(3).

[2]張軼雯,倪君君,相婷,高慧媛,李瑋,吳立軍.串聯(lián)質(zhì)譜法測定血清中20種游離氨基酸含量.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010(19).

[3]桂莉,田洪,鄭健,段煒,葉楓.高效液相色譜熒光法同時測定小鼠腦組織中4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì).第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009(8).

[4]屠春燕,趙珺,葛佳璐,吳燕嬌,唐美華,袁艷娟,韋萍.李壽椿.新型衍生試劑柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析分析測試學(xué)報(bào),2008.