吳剛 劉洋 李青 杜慧竟 游靖 李紅 柯叢玉 張欣 余吉良 趙婷

（1.華北油田采油工程研究院，任丘 062552；2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100027）

螯合球菌屬（Chelatococcus sp.）最早由Auling等［1］于1993年首次提出并描述，并經(jīng)16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育學分析將其歸屬于α-變形菌綱。螯合球菌屬現(xiàn)包含不噬糖螯合球菌（Chelatococcus asaccharovorans）、大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）及Chelatococcus sambhunathii三個菌種。C. asaccharovorans由Auling等［1］于1993年自蔗糖中分離獲得；C. daeguensis由Yoon等［2］于2008年自印染廠廢水中分離得到；C. sambhunathii由Panday等［3］于2010自溫泉沉積物中分離所得。

本研究所分離與鑒定的螯合球菌HB-4，是本課題組繼大邱螯合球菌HB-1之后，又一自華北油田地層水樣品中分離得到的螯合球菌，該菌對原油有良好的乳化降解功能、能產(chǎn)生生物表面活性劑、有機酸等代謝產(chǎn)物、能夠降低原油黏度，并經(jīng)物模試驗證明能夠提高原油采收率（文章待發(fā)表）。

華北油田開發(fā)進入中后期，增產(chǎn)挖潛的難度不斷加大，僅靠注水開發(fā)已很難提高油藏采收率，采用微生物驅油技術可提高原油采收率，主要利用微生物的代謝產(chǎn)物對原油的作用機理和微生物有效地作用于地層中的殘余油，使剩余在巖石表面、小孔道中的“死原油”變得容易流動，從而提高原油采收率。本研究對HB-4的分類地位進行系統(tǒng)準確的鑒定，旨在為進一步了解該菌的驅油機理，充分發(fā)揮其生物學功能，提高原油開采效率奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 HB-4分離自河北任丘華北油田地層水。

1.1.2 主要試劑 Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2000 Marker購自天為時代生物有限公司；GoldView購自北京塞百盛基因技術有限公司；溶菌酶購自Sigma公司、蛋白酶K購自Merk公司；API試劑條購自法國梅里埃公司；其它化學藥品均為進口分析純產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB、NA及TSA培養(yǎng)基（成品）均購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離 取已滅菌的50 mL LB液體培養(yǎng)基加入50 mL油田地層水樣品中，富集菌體培養(yǎng)48 h。采用梯度稀釋法制備10-2-10-6的系列稀釋液，取150 μL分別涂布到NA培養(yǎng)基中，37℃下培養(yǎng)48 h。挑單菌落轉接到新鮮的NA斜面上于4℃保藏。

1.2.2 形態(tài)學觀察 將菌株HB-4在NA平板上劃線培養(yǎng)，獲得單菌落，觀察其菌落形態(tài)；并利用JEM-1400型透射電鏡（TEM）觀察其菌體形態(tài)特征。

1.2.3 生理生化鑒定 酶活性、碳源利用、糖發(fā)酵產(chǎn)酸和部分生化試驗分別使用API ZYM、API 50CH（接種液為API AUX培養(yǎng)基）、API 20E及API 20NE鑒定試劑條按照使用說明進行操作。生長溫度、生長pH值、耐鹽性和抗生素敏感性試驗參考Yoon等［2］的方法進行。

1.2.4 化學成分分析

1.2.4.1 脂肪酸的測定 脂肪酸的測定方法參照劉洋等［4］的方法進行。

1.2.4.2 極性脂的測定 極性脂的測定方法參照Liu等［5］的方法進行。

1.2.4.3 醌的測定 醌的提取及純化參照劉洋等［4］的方法進行。取凍干菌體約150 mg，加入氯仿∶甲醇=2∶1（V/V）的溶液40 mL，在黑暗處磁力攪拌10 h左右。用濾紙過濾懼濾液。用減壓旋轉蒸發(fā)儀40℃-45℃減壓蒸餾至干燥，棄餾液。用丙酮溶液1-2 mL重新溶解干燥物，長條狀點樣于GF254硅膠板（規(guī)格50×200 mm，青島海洋化工廠分廠）上。以甲苯作展層劑展層約20 min，取出風干。在波長254 nm紫外燈下觀察，在綠色熒光背景下呈暗褐色的帶即為泛醌的位置（Rf=0.4）。刮下Rf=0.4的帶，置于5 mL小燒杯中，用1 mL氯仿溶解，然后用細菌濾器抽濾除去硅膠，收集濾液及洗液，即得泛醌的氯仿溶液。置于4℃黑暗處保存。流動相為甲醇：異丙醇溶液，比例為4∶1，流速為1 mL/min，柱溫為40℃，270 nm紫外檢測。根據(jù)標準菌株泛醌組分與洗脫時間的關系（參考標準菌株），分析未知菌株。

1.2.5 分子生物學鑒定

1.2.5.1 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析 利用細菌基因組DNA提取試劑盒（Tiangen公司）提取試驗菌株基因組DNA，具體步驟參見試劑盒說明書。提取的基因組DNA用0.8%的瓊脂糖進行檢測。以基因組DNA為模板，利用通用引物對16S rRNA基因進行擴增。引物序列為：正向引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'），反向引物1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）［5］。50 μL PCR反 應體系：50 ng DNA模板，1×Taq reaction buffer，引物各20 pmol，20 μmol dNTP，1.5 U Taq酶（Ferments）。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，52℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖進行檢測。純化后的PCR產(chǎn)物用ABI3700基因測序儀測序。測序由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。測序結果用Chromas軟件參照正反序列圖譜人工校對。將測序得到的結果在EzTaxon server 2.1進行比對［6］，確定與已知序列的同源關系。采用CLUSTAL W進行多序列比對［7］，并利用N-J法通過MEGA 4軟件進行系統(tǒng)發(fā)育及分子進化分析［8］。

1.2.5.2 遺傳特征測定 熱變性法測定DNA的G+C含量與復性速率法測定DNA/DNA同源性參照東秀珠等［9］方法進行。參考菌株為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis） K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T。

2 結果

2.1 形態(tài)學特征觀察

HB-4細胞近球狀，1.11 μm×1.28 μm，端生鞭毛1-2根，表面光滑，單個或成對排列；革蘭氏陰性，不生孢（圖1）。在TSA培養(yǎng)基上菌落乳白色，圓形，表面凸起，光滑，反光，半透明，邊緣整齊，直徑約為1.0 mm。

圖1 HB-4的透射電鏡細胞形態(tài)觀察

2.2 生理生化特征鑒定

HB-4具有氧化酶、接觸酶、酯酶（C4）、類脂酯酶（C8）、白氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶及萘酚-AS-BI-磷酸水解酶等酶活性；最適生長溫度為37℃；能夠利用24種碳源。對鏈霉素、氯霉素、氨芐西林、慶大霉素、四環(huán)素、卡那霉素及新霉素等抗生素敏感。HB-4生理生化特征具體結果詳見表1。

2.3 化學成分分析

表2 HB-4脂肪酸組分分析

圖2 HB-4脂肪酸測定氣相色譜圖

圖3 HB-4極性脂TLC薄層層析顯色圖

根據(jù)MIDI微生物鑒定系統(tǒng)分析結果，HB-4主要脂肪酸組成（≥10%）分別為C18：1ω7c （47.01%）和C19：0cyclo ω8c（21.83%），其他組分結果見表2和圖2。HB-4的極性脂主要為DPG（diphosphatidylglycerol）、PE（phosphatidylethanolamine）、PG （phosphatidylglycerol）及PC（phosphatidylcholine），見圖3。HB-4的主要呼吸醌組份為Q-10（泛醌-10），約占97%，見圖4。

表1 HB-4生理生化特征

圖4 HB-4泛醌270 nm紫外檢測結果

2.4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

圖5 菌株HB-4 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育分析

利用引物27f和1492r擴增得到HB-4的16S rRNA基因序列，序列長度為1 448 bp，GenBank序列登錄號為JX658137。在GenBank數(shù)據(jù)庫中通過Blast方法比對，采用MEGA 4軟件用N-J法構建HB-4與相關模式菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖5）。HB-4與Chelatococcus daeguensis K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T聚類在一個系統(tǒng)發(fā)育分支，序列同源性為98%以上，可確定HB-4為Chelatococcus sp.。

2.5 遺傳特征測定

圖6 E.coli K12 Tm值測定圖

圖6和圖7分別為對照菌株（E.coli K12）和HB-4 Tm值的測定圖。根據(jù)公式計算，基因組DNA的G+C含量為65.8 mol%，符合Chelatococcus屬的G+C含量的數(shù)值范圍。圖8和圖9為待測菌株與近緣兩模式菌株同源性的測定圖，經(jīng)計算，HB-4同模式菌株Chelatococcus daeguensis K106T及Chelatococcus sambhunathii HT4T的DNA同源性分別為84.9%和47.2%。通過DNA/DNA（雜交）同源性測定可以初步判斷HB-4應為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。

圖7 HB-4 Tm值測定圖

圖8 HB-4與K106T同源性測定圖

圖9 HB-4與HT4T同源性測定圖

3 討論

本研究利用細菌通用引物對HB-4的16S rRNA基因序列擴增和序列測定，并通過GenBank數(shù)據(jù)庫進行分析比較和利用MEGA 4進行系統(tǒng)進化分析，HB-4被鑒定為螯合球菌屬（Chelatococcus sp.）。以基因系統(tǒng)發(fā)育分析為基礎，結合形態(tài)及培養(yǎng)特征、生理生化試驗、化學成分分析及遺傳特征測定結果，并綜合參考螯合球菌屬中現(xiàn)存3個菌種的相關報道［1-3］，最終確定HB-4為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。

本研究所分離得到的大邱螯合球菌HB-4，是本課題組繼大邱螯合球菌HB-1（文章待發(fā)表）之后，又一自華北油田地層水樣品中分離得到的螯合球菌菌株，其在相關酶活性及抗生素敏感性等生理生化特征方面與HB-1存在細微的差異。目前關于螯合球菌的生物學功能的研究僅在反硝化作用方面有所報道［10］，而對其在石油原油開采領域的生物學功能及其機制機理的研究尚鮮有報道，這方面的研究有待進一步深入的開展。

微生物的形態(tài)特征是由遺傳物質和生存環(huán)境等因素共同決定的，利用基于形態(tài)學、生理生化及分子生物學等技術的多相分類鑒定方法現(xiàn)已廣泛應用于微生物分類學研究領域［4］。利用微生物多相分類鑒定技術對油田地層水HB-4鑒定至“種”水平，確定其準確的分類地位，為進一步了解和發(fā)揮這類螯合球菌的生物學功能及實現(xiàn)其生產(chǎn)利用價值奠定重要的基礎。

4 結論

本研究針對自華北油田地層水中分離得到的細菌HB-4進行多相分類學鑒定，并最終將HB-4鑒定為大邱螯合球菌（Chelatococcus daeguensis）。該菌株具有一些特殊的生理生化特征及酶學活性，具有重要的理論研究與實踐應用價值。

［1］ Auling G, Busse HJ, Egli T, et al. Description of the Gram-negative, obligately aerobic, nitrilotriacetate （NTA） -utilizing bacteria as Chelatobacter heintzii, gen. nov., sp. nov., and Chelatococcus asaccharovorans, gen. nov., sp. nov ［J］. Syst Appl Microbiol, 1993, 16（1）：104-112.

［2］ Yoon JH, Kang SJ, Im WT, et al. Chelatococcus daeguensis sp. nov., isolated from waste water of a textile dye works, and emended description of the genus Chelatococcus ［J］. IJSEM, 2008, 58（9）：2224-2228.

［3］ Panday D, Das SK. Chelatococcus sambhunathii sp. nov., a moderately thermophilic alphaproteobacterium isolated from hot spring sediment ［J］. IJSEM, 2010, 60（4）：861-865.

［4］ 劉洋, 趙婷, 姚粟, 等.一株芝麻香型白酒高溫大曲嗜熱放線菌的分離與鑒定［J］.生物技術通報, 2012（10）：210-216.

［5］ Liu Y, Liu L, Qiu F, et al. Paenibacillus hunanensis sp. nov., isolated from rice seeds ［J］. IJSEM, 2010, 60（6）：1266-1270.

［6］ Chun J, Lee JH, Jung Y, et al. EzTaxon：a web-based tool for the identification of prokaryotes based on 16S ribosomal RNA gene sequences ［J］. IJSEM, 2007, 57（10）：2259-2261.

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［9］ 東秀珠, 蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京：科學出版社, 2001：399-402.

［10］ 張苗, 黃少斌.高溫好氧反硝化菌的分離鑒定及其反硝化性能研究［J］.環(huán)境科學, 2011, 32 （1） ：259-265.