信吉閣 肖晶 查星琴 成文敏 卿玉波 潘偉榮 曾養(yǎng)志 魏紅江

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201；2.云南省版納微型豬近交系重點實驗室，昆明 650201）

版納微型豬主要分布于云南西雙版納傣族自治州境內(nèi)的拉祜族、哈尼族，布朗族和瑤族等少數(shù)民族居住地區(qū)，是我國珍貴的地方品種資源。主要特點表現(xiàn)為體型矮小，生長速度緩慢而性成熟早，是培育醫(yī)學(xué)試驗動物理想的素材。版納微型豬近交系是曾養(yǎng)志教授利用云南特有地方豬種資源，采用連續(xù)高度近交加嚴(yán)格選擇的科學(xué)方法，歷經(jīng)了早期世代中存在的嚴(yán)重近交衰退現(xiàn)象，經(jīng)過30多年的連續(xù)高度近交，培育成功的基因高度純合、遺傳背景清楚而又具有遺傳多樣性的大型哺乳類試驗動物近交系，在生物醫(yī)學(xué)研究、異種器官移植、轉(zhuǎn)基因動物研究以及生命科學(xué)研究有著廣泛的應(yīng)用前景，并有望逐步發(fā)展形成特有的生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)［1-3］。近年來云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏紅江教授建立了動物轉(zhuǎn)基因和體細(xì)胞克隆技術(shù)平臺，并于2010年1月得到了世界首只版納微型豬近交系克隆豬，并陸續(xù)得到了多頭克隆豬和轉(zhuǎn)基因豬，突破了近交系豬克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)［4，5］。

胎兒成纖維細(xì)胞是克隆技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最常用的供體細(xì)胞［6-8］，體細(xì)胞克隆技術(shù)在動物育種、制備轉(zhuǎn)基因動物、基因治療和器官移植等方面具有重大的作用和廣闊的應(yīng)用前景。而確定克隆和轉(zhuǎn)基因試驗中使用的供體細(xì)胞的性別，對下一步的克隆動物，轉(zhuǎn)基因動物的鑒定、研究和利用有很重要的意義。目前，其中最為常用的就是SRY-PCR法，即通過擴(kuò)增位于Y染色體上的性別決定區(qū)（Sex-Determination Region）的基因片段來判定胚胎或者細(xì)胞的性別［9］，具有特異性強(qiáng)、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點，而成為目前應(yīng)用較為廣泛的方法。本研究采用膠原酶消化法對同胎妊娠35 d的7只版納微型豬胎兒進(jìn)行成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)，并利用SRY-PCR法鑒定豬胎兒的性別，旨在建立一種快速、準(zhǔn)確的版納微型豬近交系豬胎兒性別鑒定方法，為進(jìn)一步的轉(zhuǎn)基因、基因敲除研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 剖腹產(chǎn)手術(shù)采集發(fā)育到約35 d的版納微型豬近交系豬胎兒，共7頭（編號1、2、3、4、5、6、7），放入到含10% FBS的DMEM中，用冰盒中帶回實驗室細(xì)胞間。

1.1.2 試劑 DMEM/F12培養(yǎng)基、青霉素、鏈霉素、血清購自Gibco公司；膠原酶、配置PBS所用的試劑購自Sigma公司；細(xì)胞培養(yǎng)所用的耗材為JET BIOFIL（廣州）產(chǎn)品。細(xì)胞基因組提取試劑盒購自于天根公司，引物由上海生工公司合成，Taq酶、Marker等分子試劑購自TaKaRa公司；M（公豬）、F（母豬）這2頭已知性別豬的基因組DNA由實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng) 小心剝離胎兒及胎衣，將胎兒放置在PBS（含100 IU/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素）中，去除頭，四肢，內(nèi)臟等組織，清洗3遍后剪碎整個胎兒組織，加入1 mg/mL 膠原酶消化液10 mL，放入37℃培養(yǎng)箱消化2-4 h，其間吹打幾次并觀察消化情況；消化完畢后，將其轉(zhuǎn)移到15 mL 的離心管中，1 000 r/min，5 min，收集細(xì)胞，棄上清后將細(xì)胞用DMEM/F12+10% FBS清洗兩次，用含15%的FBS，100 IU/mL 青霉素，100 μg/mL 鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)細(xì)胞。第2天觀察細(xì)胞貼壁情況，并換液，細(xì)胞形成細(xì)胞單層（80%-90%匯合）后進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.2.2 胎兒成纖維細(xì)胞基因組的提取 取6孔板中的一孔細(xì)胞，用0.05% Trysin-EDTA消化3 min，離心收集細(xì)胞沉淀，按照天根公司基因組提取試劑盒的操作說明提取7個細(xì)胞系的DNA，使用紫外分光光度計檢測提取到的基因組DNA濃度。

1.2.3 引物設(shè)計與SRY-PCR 參照GenBank中豬SRY基因（GenBank登錄號：U49860.2）和β-actin基因（GenBank登錄號：XM_003124280.2）的基因序列，使用引物設(shè)計軟件Primer Premier5.0，設(shè)計2對PCR擴(kuò)增引物，引物序列為：SRY-Forward Primer（SRY-F）：5'-GCTCTCATTGTGTGTTCTCGT-3'，SRYReverse Primer（SRY-R）：5'-CTTAGCGACTGTGTATGTGTAG-3'，β-actin-Forward Primer（β-actin-F）：5'-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3'，β-actin-Reverse Primer（β-actin-R）：5'-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3'，擴(kuò)增片段大小分別為309 bp和132 bp。其中β-actin基因作為內(nèi)參基因，并以已知性別的公豬（M）為陽性對照，母豬（F）為陰性對照，進(jìn)行多重PCR。

采用20 μL反應(yīng)體系，Ex Taq 0.5 μL，25 mmol/L dNTP Mix buffer 2 μL，10× Ex Taq Buffer 2 μL，10 pmol/μL引 物SRY-F、SRY-R、β-actin-F、β-actin-R各1 μL，基 因 組DNA模 板1 μL（2.5 ng），ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)采用Touchdown程序，條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，10個循環(huán)；95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)；72℃延伸8 min。取5 μL PCP產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結(jié)果

2.1 豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)

經(jīng)膠原酶分離，鏡下觀察可見到大量單個細(xì)胞懸浮在培養(yǎng)液中。接種培養(yǎng)6 h后觀察到大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞呈圓形，尚未伸展。12 h后觀察，已有許多細(xì)胞貼壁，并開始伸展，原來圓形細(xì)胞伸出偽足，細(xì)胞形狀不規(guī)則。培養(yǎng)3-5 d后，細(xì)胞伸展，呈梭形、多角形等，為典型的成纖維細(xì)胞形態(tài)，胞質(zhì)近中央處有橢圓形細(xì)胞核，核仁清晰可見。細(xì)胞生長旺盛，3-4 d后，細(xì)胞已匯合成單層鋪滿培養(yǎng)瓶底壁，可傳代或凍存（圖1）。

圖1 豬胎兒成纖維細(xì)胞

2.2 PCR擴(kuò)增及性別鑒定結(jié)果

共提取了7個版納微型豬成纖維細(xì)胞系細(xì)胞的基因組，經(jīng)過紫外分光光度計的檢測，其濃度和純度均符合擴(kuò)增要求。圖2顯示，公豬M（陽性對照）擴(kuò)增出了2條帶，分別為309 bp的Y染色體特異SRY基因片段和132 bp的β-actin基因片段；母豬（陰性對照）只擴(kuò)增出132 bp的β-actin基因片段；在水（空白對照）中，沒有擴(kuò)增出任何條帶。2、3泳道擴(kuò)增出SRY基因片段和內(nèi)參基因片段，應(yīng)為雄性胚胎，1、4、5、6、7泳道只擴(kuò)增出內(nèi)參基因，應(yīng)為雌性胚胎，8泳道為公豬M（陽性對照），9泳道為母豬F（陰性對照），10泳道為單一SRY基因引物擴(kuò)增公豬基因組DNA，擴(kuò)增出309 bp SRY基因片段，11、12泳道為單一的內(nèi)參基因擴(kuò)增公豬M，母豬F的基因組DNA，擴(kuò)增出132 bp的β-actin基因片段。

PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程股份有限公司測序。測序結(jié)果與NCBI上發(fā)表的SRY基因序列比對，具有99%同源性，進(jìn)一步說明了性別鑒定結(jié)果的正確性。

圖2 胎兒成纖維細(xì)胞系PCR性別鑒定結(jié)果

3 討論

本試驗中采用膠原酶分離法成功獲得了7只豬胎兒的成纖維細(xì)胞，為后續(xù)的核移植研究、誘導(dǎo)性多功能干細(xì)胞研究奠定了基礎(chǔ)。試驗中用到的膠原酶一般是從溶組織梭狀細(xì)胞芽孢桿菌提取制備的，主要水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分。如消化的組織較硬，內(nèi)含較多結(jié)締組織或膠原成分時，可采用膠原酶解離細(xì)胞法，適用于消化分離纖維性組織、上皮及癌組織，Ca2+、Mg2+和血清對其活性無抑制作用，對細(xì)胞損傷小。使用時應(yīng)選擇適宜的濃度、溫度和作用時間［10］。多個研究報道采用膠原酶消化法成功分離了豬胎兒成纖維細(xì)胞［11，12］。但試驗中發(fā)現(xiàn)因為胚胎組織細(xì)胞種類較多，雖然除去頭、尾、四肢、內(nèi)臟等，但仍然可見到上皮樣細(xì)胞（呈星型或三角狀）、神經(jīng)細(xì)胞、游走型細(xì)胞。這些雜細(xì)胞會在反復(fù)傳代過程中被逐漸淘汰掉。隨著培養(yǎng)時間的延長，整個細(xì)胞群體呈現(xiàn)火焰狀和旋渦狀成群細(xì)胞呈現(xiàn)放射狀、漩渦狀等形式。

家畜早期胚胎的性別鑒定是家畜胚胎移植的重要內(nèi)容，對實現(xiàn)動物性別的人為控制具有重要意義。而在轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)以及基因敲除研究中，人為控制出生后代的性別，可以最大限度地利用其與性別相關(guān)的性狀，提高科研價值和經(jīng)濟(jì)效益。SRY基因是睪丸決定因子的最佳候選基因，普遍存在于哺乳動物Y染色體中，SRY基因的檢測可以特異而快速地判定性別。研究者李小平［13］，曹海峰［14］和尹智［11］也采用了類似PCR的方法鑒定了豬胎兒的性別，本試驗采用的SRY-PCR方法，完成了7只版納微型豬胎兒的性別鑒定，避免了利用巢式PCR方法從核移植胚胎中獲得細(xì)胞對胚胎的損傷，解決了需進(jìn)行兩輪PCR，試驗繁瑣、時間長的問題。另外PCR反應(yīng)采用Touchdown程序，優(yōu)化了擴(kuò)增環(huán)境，避免了普通多重PCR擴(kuò)增只有一個退火溫度，引物之間退火溫度不一致，影響擴(kuò)增效率的問題，降低了試驗難度。同時與染色體核型分析法，抗原法，X染色體相關(guān)酶法，染色體特異DNA探針法等性別鑒定方法相比，SRY-PCR應(yīng)用性更強(qiáng)，可在生產(chǎn)實踐廣泛地推廣。

4 結(jié)論

采用膠原酶消化成功分離版納微型豬胎兒進(jìn)行成纖維細(xì)胞，并利用SRY-PCR法鑒定了豬胎兒的性別，建立了一種快速、準(zhǔn)確的版納微型豬近交系豬胎兒性別鑒定的方法，為轉(zhuǎn)基因、基因敲除試驗特定性別供體細(xì)胞的選擇提供可靠的技術(shù)依據(jù)。

［1］ Wang L, Lu XF, Lu YR, et al. Immunogenicity and immune modulation of osteogenic differentiated mesenchymal stem cells from Banna minipig inbred line ［J］. Transplant Proc, 2006, 38（7）：2267-2269.

［2］ Yu P, Zhang L, Li SF, et al. Screening and analysis of porcine endogenous retrovirus in Chinese Banna minipig inbred line ［J］. Transplant Proc, 2004, 36：2485-2487.

［3］ Tan WD, Chen YN, Lu YR, et al. Expression sequence tags research of a cDNA library from liver tissue of Banna minipig inbred line ［J］. Am J Transpl, 2006, 82（1）：1054-1055.

［4］ 信吉閣.版納微型豬近交系體細(xì)胞核移植的基礎(chǔ)研究［D］.昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2007.

［5］ 卿玉波.不同品種受體母豬對版納微型豬近交系核移植效果影響［D］.昆明：云南農(nóng)業(yè)大學(xué), 2009.

［6］ Betthauser J, Forsberg E, Augenstein M, et al. Production of cloned pigs from in vitro systems ［J］. Nature Biotechnology, 2000, 18：1055-1059.

［7］ Heyman Y, Chavatte-Palmer P, Lebourhis D, et al. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos ［J］. Biol Reprod, 2002, 66（1）：6-13.

［8］ Yin XJ, Lee HS, Lee YH, et al. Cats cloned from fetal and adult somatic cells by nuclear transfer ［J］. Reproduction, 2005, 129（2）：245-249.

［9］ Kunieda T, Xian M, Kobayashi E, et al. Sexing of mouse preimplantation embryos by detection of Y chromosome-specific sequences using polymerase chain reaction ［J］. Biology of Reproduction, 1992, 46（4）：692-697.

［10］ 司徒鎮(zhèn)強(qiáng), 吳軍正.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.北京：世界圖書出版公司, 2007.

［11］ 尹智, 孔慶然, 格日樂其木格, 等.應(yīng)用雙重PCR技術(shù)鑒定豬胎兒性別及其細(xì)胞系建立［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2008, 39（9）：49-52.

［12］ 張晟, 肖高芳, 黃黎珍, 等.借助慢病毒將EGFP基因?qū)胛鞑匦⌒拓i胎兒成纖維細(xì)胞［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 20（4）：34-36.

［13］ 李小平, 袁婷, 高飛, 等.雙溫多重PCR鑒定豬早期胚胎性別的研究［J］.中國農(nóng)學(xué)通報, 2010, 26（14）：34-36.

［14］ 曹海峰, 隨劉才, 季索菲, 等.梅山豬胎兒成纖維細(xì)胞的分離培養(yǎng)及SRY-PCR法快速性別鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2011, 38（6）：907-910.