陳婷婷，王麗芳，王 琪，韓建榮

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

蘆筍（Asparagus officinalis L.）為百合科天門冬屬多年生草本植物，又名石刁柏、龍須菜，原產(chǎn)于歐洲、北非和西亞[1-3]。因其較高的藥食兼用價(jià)值而在我國各地廣泛栽培，山西是全國最大的蘆筍產(chǎn)區(qū)[4]。蘆筍的可食部分是其嫩莖，每年過了收獲季節(jié)以后，蘆筍的地上莖仍要繼續(xù)生長，可長到1.5～2.0 m，繼續(xù)生長的地上莖稱為蘆筍老莖。蘆筍老莖主要由纖維素（40.2%）、半纖維素（19.8%）和木質(zhì)素（17.9%）構(gòu)成[5]。與蘆筍嫩莖相比，老莖由于木質(zhì)纖維化程度較高，失去了食用價(jià)值，致使大量的蘆筍老莖收割后沒有被充分利用，只能任其自然腐敗或直接焚燒，這樣既造成資源的極大浪費(fèi)，也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染。

針對(duì)如何利用蘆筍老莖資源的問題，山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室開展了一系列研究工作，已經(jīng)證明了蘆筍老莖經(jīng)堆制發(fā)酵后可用來栽培姬松茸（Agaricus blazei）[6]。研究表明，嗜熱放線菌是蘑菇堆肥高溫期的主要優(yōu)勢菌群[7-8]。蘑菇堆肥是一個(gè)復(fù)雜而又獨(dú)特的微生態(tài)系統(tǒng)，是一種由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個(gè)微生物群體共同作用有效分解有機(jī)物的動(dòng)態(tài)生化過程[9]。目前，有關(guān)于雙孢菇培養(yǎng)料（主要是麥稈）發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[10]，還有針對(duì)豬糞堆肥[11]、污泥[12]、生活垃圾堆肥[13]等微生物群落的研究，而針對(duì)蘆筍老莖堆肥的研究還未見報(bào)道。

本試驗(yàn)對(duì)蘆筍老莖堆肥中的嗜熱放線菌進(jìn)行了初步的分離鑒定研究，旨在為制備蘆筍老莖堆料發(fā)酵菌劑及調(diào)控堆料過程提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 堆肥配方 蘆筍老莖70%，棉籽殼20%，豆餅7.5%，過磷酸鈣1%，石膏粉1%，尿素0.5%（要求蘆筍老莖及其他輔料無霉變，切成20 cm左右的小段，然后將蘆筍老莖浸透水，預(yù)濕后與其他輔料攪拌建堆）。料堆一般底寬120～150 cm，上寬80～90 cm，高80～100 cm。

1.1.2 堆制過程 按2次發(fā)酵法[14-15]發(fā)酵堆料，室外前發(fā)酵18 d，共翻堆4次；移入室內(nèi)進(jìn)行后發(fā)酵，60℃保持10 h，50℃保持4 d。后發(fā)酵結(jié)束后，調(diào)整培養(yǎng)料的含水量到65%，pH值為7.0～7.5。

1.1.3 采樣 以蘆筍老莖堆肥的堆體四周及中心處為采樣點(diǎn)，采樣深度為20 cm左右，采用四分法采樣。在前發(fā)酵每次翻堆前和后發(fā)酵前后進(jìn)行采樣，共采6次，即建堆后第4天（A）、第6天（B）、第9天（C）、第11天（D）、第15天（E）和第22天（F），于4℃保存。試驗(yàn)前將樣品風(fēng)干2 d，放入烘箱，置于120℃下1 h[16-17]。

1.1.4 培養(yǎng)基 高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。121℃滅菌20 min。倒平板時(shí)，每200 mL培養(yǎng)基添加10 mg的K2Cr2O7[18]作抑菌劑。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離 準(zhǔn)確稱取樣品1 g，加入裝有99 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約30 min，吸取1 mL樣品懸液加入裝有9 mL無菌水的試管中，吹洗多次，讓菌液混合均勻，即成10-3稀釋液。依此類推，分別制成10-4，10-5稀釋液。分別吸取10-3，10-4，10-5懸液0.2 mL涂布于高氏Ⅰ號(hào)平板上，45℃培養(yǎng)3 d，觀察并挑取單菌落，在平板上再劃線純化。將純化后的菌株分別按“樣品編號(hào)＋G（代表放線菌）＋數(shù)字”編號(hào)。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察 平板劃線培養(yǎng)3 d后，觀察菌落的大小、形態(tài)、正反面顏色、厚薄、質(zhì)地、表面狀況及是否產(chǎn)色素。插片培養(yǎng)2 d后，觀察菌絲、孢子絲的形狀和特點(diǎn)。美蘭染色參照文獻(xiàn)[19]。

1.2.2.2 16SrDNA的擴(kuò)增 選取菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的放線菌菌株通過菌落PCR法[20]提取16SrDNA，擴(kuò)增引物采用16SrDNA通用引物：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1541R，5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增體系：10×TransEasy Taq Buffer 2.5μL，dNTP1μL，引物（20μmol/L）各2.5μL，Trans Easy Taq DNA polymerase 0.5μL，加模板7.5μL，ddH2O補(bǔ)至25μL。各試劑加好后，輕輕混勻。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火55℃，30 s；延伸72℃，90 s；35個(gè)循環(huán)后，72℃保溫10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和回收產(chǎn)物均經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，UV凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.2.3 16SrDNA片段PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化、測序 向無菌離心管中加入目的片段16SrDNA回收產(chǎn)物4μL和載體1μL，混勻后于25℃反應(yīng)30 min，4℃反應(yīng)16 h進(jìn)行連接。將5μL連接產(chǎn)物全部加入感受態(tài)細(xì)胞（100μL）中，溫和混勻，冰浴放置30 min；迅速轉(zhuǎn)入42℃水浴，熱激30 s，再迅速冰浴冷卻2 min后，加入900μL的LB培養(yǎng)基，37℃下90 r/min振蕩培養(yǎng)50 min；然后離心，棄掉大部分上清，剩下的用移液器吹勻，加入10μLIPTG（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）和20μL X-gal（20 mg/mL），混勻后輕輕涂到LB平板（含有氨芐青霉素）；37℃培養(yǎng)12～16 h后可見藍(lán)色菌落。挑取白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素），37℃下200 r/min過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的菌液分成2管，1管提取質(zhì)粒DNA作酶切篩選用，1管留作測序用。Eco RI限制性內(nèi)切酶酶切篩選：向無菌EP管中依次加入8μL ddH2O，0.5μL Eco R I Buffer，1μL質(zhì)粒DNA，0.5μL Eco R I，于37℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有目的片段重組子的大小共約4 600 bp。選取含目的片段的重組子送華大基因研究中心進(jìn)行測序。本試驗(yàn)樣品來自于蘆筍老莖堆肥，克隆編號(hào)方法采用“ASC＋重組子號(hào)”。

1.2.2.4 菌株16SrDNA序列的同源性分析 將測序獲得的陽性克隆的16SrDNA序列運(yùn)用CHECK_CHIMERA程序在線進(jìn)行嵌合體檢驗(yàn)并去除明顯的Chimera序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫中用VECTOR SCREEN程序剔除載體序列，經(jīng)BLAST比對(duì)后對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析。將獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中最相似的序列一起使用軟件Clustal X 1.8和MEGA 3.1，采用鄰近法（Neighor Joining），在Kimura雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter）下，繪制相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹和Bootstrap檢驗(yàn)系統(tǒng)樹，自展值設(shè)為1 000。

1.2.2.5 16SrDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號(hào) 本研究所獲得16SrDNA序列已提交Gen-Bank數(shù)據(jù)庫，登錄號(hào)分別為：JQ358562，JQ358563，JQ358585，JQ358587，JQ358588，JQ358594～JQ35 8596，JQ358598，JQ358599，JQ358602，JQ358607，JQ358565，JQ358567，JQ358569，JQ358572～JQ35 8575，JQ358577，JQ358578，JQ358580，Q358583。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

采用稀釋涂布法從蘆筍老莖堆肥的6個(gè)樣品中分離到菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的23個(gè)放線菌菌株，其中，A樣品3株，B樣品8株，C樣品1株，D樣品2株，E樣品3株，F(xiàn)樣品6株。編號(hào)分別為：AG1～AG3；BG1～BG8；CG1；DG1，DG2；EG1～EG3；FG1～FG6。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 23株放線菌經(jīng)形態(tài)觀察都屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），都有螺旋或（和）波曲形狀的孢子絲；基絲生長良好，多分支，不形成橫隔，也不斷裂。菌落形狀以圓形為主，其中，BG7菌落是無規(guī)則形；菌落正面顏色以不同層次的灰色和黑色為主，其中，BG7和FG5菌落為灰綠色；一般菌落凸起，表面粉粒狀，其中，AG2，BG2，CG1，DG1和EG1菌落表面較平坦?jié)駶櫋?3株鏈霉菌中，有4株產(chǎn)色素，分別是AG2產(chǎn)褐色色素、BG3產(chǎn)醬色色素、EG2和FG4產(chǎn)黃色色素。

2.2.2 16SrDNA的擴(kuò)增 每株菌取10個(gè)單菌落，加1 mL ddH2O煮沸5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液作模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中，1株放線菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1所示，可見獲得條帶約為1.6 kb的16SrDNA序列。

2.2.3 16SrDNA序列測定和比對(duì) 測序后，將23株鏈霉菌的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的序列進(jìn)行比對(duì)（表1）。

表1 樣品中的放線菌菌株按照16S rDNA 序列的比對(duì)結(jié)果

由表1可知，A樣品3個(gè)菌株分別與白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus（GQ925802），熱普通鏈霉菌 Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），Streptomyces sp.（AM889494）的同源性最高；B樣品8個(gè)菌株分別與白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus（GQ925802），熱普通鏈霉菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），Streptomyces sp.（HQ596202），假淺灰鏈霉菌Streptomyces pseudogriseolus（X80827），Streptomyces sp.（JF502572），刺棘鏈霉菌Streptomyces espinosus（X80826），Streptomyces sp.（X81574），Streptomyces sp.（GU045531）的同源性最高；C樣品1個(gè)菌株與熱普通鏈霉菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405）的的同源性最高；D樣品2個(gè)菌株分別與熱普通鏈莓菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus （GQ925802）的同源性最高；E樣品3個(gè)菌株分別與熱普通鏈霉菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），Streptomyces sp.（AM889494），Streptomyces sp.（GU045531）的同源性最高；F樣品6個(gè)菌株分別與白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus（GQ925802），Streptomyces sp.（HQ596202），假淺灰鏈霉菌Streptomyces pseudogriseolus（X80827），Streptomyces sp.（AM889494），Streptomyces sp.（DQ092377），Streptomyces sp.（GU045531）的同源性最高。

由測序比對(duì)結(jié)果可知，23株鏈霉菌中，4株的序列與白淺灰鏈霉菌的同源性最高，5株的序列與熱普通鏈霉菌的同源性最高，2株的序列與假淺灰鏈霉菌的同源性最高，1株的序列與刺棘鏈霉菌的同源性最高，有11株在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找到與其相似的已知鏈霉菌種的序列，分類地位待定。結(jié)果說明，蘆筍老莖堆肥中優(yōu)勢的嗜熱可培養(yǎng)放線菌主要是白淺灰鏈霉菌和熱普通鏈霉菌。

根據(jù)6個(gè)樣品中23株鏈霉菌的16SrDNA序列和同源性最高的已知菌株的序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

3 討論

本研究在分離嗜熱放線菌時(shí)，首先對(duì)樣品進(jìn)行了物理處理，即120℃烘1 h，然后在分離的高氏Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中添加抑菌劑，一方面可以促進(jìn)放線菌孢子的萌發(fā)，另一方面可以除掉大部分的細(xì)菌、真菌。母連軍[16]、司美茹等[21-22]發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臒崽幚砜梢源龠M(jìn)放線菌孢子活化，能有效地提高放線菌的種類和數(shù)量；在分離的培養(yǎng)基中添加化學(xué)抑菌劑或抗生素，也可提高放線菌的出菌量。司美茹等[21]利用9種培養(yǎng)基來分離特殊環(huán)境中的放線菌發(fā)現(xiàn)，高氏Ⅰ號(hào)分離得到的放線菌數(shù)量和種類最多。本試驗(yàn)在分離的過程中，完全沒有細(xì)菌、霉菌的干擾，而且嗜熱放線菌的出菌量較好。

本試驗(yàn)通過菌落PCR方法，直接煮沸菌體導(dǎo)致細(xì)胞破裂，以暴露出的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果證明，該方法可以對(duì)蘆筍老莖堆肥中分離到的放線菌進(jìn)行大規(guī)模的鑒定。菌落PCR方法不僅大大減少了工作量，而且提高了試驗(yàn)效率。從電泳圖上可以看出，菌落PCR還存在著一些非特異性的結(jié)合，可能是因?yàn)槟０逯写嬖谄渌鞍踪|(zhì)和多糖等雜質(zhì)影響或抑制了擴(kuò)增反應(yīng)，導(dǎo)致擴(kuò)增效果不太理想。但是如果用作定性檢測，菌落PCR不僅能得到與常規(guī)PCR相同的結(jié)論，還可以節(jié)省大量的人力和物力，是一種切實(shí)可行的檢測方法。

微生物群落及其結(jié)構(gòu)在堆料物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起著非常重要的作用，堆料中微生物數(shù)量及種群分布與堆肥中有機(jī)物質(zhì)成分和含量、微生物間的相互作用等多種因素密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果表明，蘆筍老莖堆肥中的嗜熱放線菌主要是鏈霉菌，而且?guī)缀醴蛛x到的放線菌都屬于鏈霉菌。23株鏈霉菌中，有11個(gè)菌株在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找到與其相似的已知菌株的序列，分類地位待定，這為下一步從蘆筍老莖堆肥中篩選分離有價(jià)值的新嗜熱可培菌提供了可能。本研究只分離到屬于鏈霉菌屬的嗜熱放線菌，沒有分離到像高溫放線菌（Thermoactinomyces） 和高溫單孢菌（Thermomonospora）等屬的嗜熱放線菌，這可能是因?yàn)樵谔J筍老莖堆肥過程中起作用的嗜熱放線菌主要是鏈霉菌，也可能是因?yàn)檫x用的高氏Ⅰ號(hào)分離培養(yǎng)基不適合其他嗜熱放線菌的生長。在下一步的分離工作中，有必要選擇更多的分離培養(yǎng)基來進(jìn)行比較研究。

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