陳婷婷，王麗芳，王 琪，韓建榮

（1.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西太原030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

蘆筍（Asparagus officinalis L.）為百合科天門冬屬多年生草本植物，又名石刁柏、龍須菜，原產(chǎn)于歐洲、北非和西亞[1-3]。因其較高的藥食兼用價值而在我國各地廣泛栽培，山西是全國最大的蘆筍產(chǎn)區(qū)[4]。蘆筍的可食部分是其嫩莖，每年過了收獲季節(jié)以后，蘆筍的地上莖仍要繼續(xù)生長，可長到1.5～2.0 m，繼續(xù)生長的地上莖稱為蘆筍老莖。蘆筍老莖主要由纖維素（40.2%）、半纖維素（19.8%）和木質(zhì)素（17.9%）構(gòu)成[5]。與蘆筍嫩莖相比，老莖由于木質(zhì)纖維化程度較高，失去了食用價值，致使大量的蘆筍老莖收割后沒有被充分利用，只能任其自然腐敗或直接焚燒，這樣既造成資源的極大浪費，也帶來了嚴(yán)重的環(huán)境污染。

針對如何利用蘆筍老莖資源的問題，山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室開展了一系列研究工作，已經(jīng)證明了蘆筍老莖經(jīng)堆制發(fā)酵后可用來栽培姬松茸（Agaricus blazei）[6]。研究表明，嗜熱放線菌是蘑菇堆肥高溫期的主要優(yōu)勢菌群[7-8]。蘑菇堆肥是一個復(fù)雜而又獨特的微生態(tài)系統(tǒng)，是一種由群落結(jié)構(gòu)演替非常迅速的多個微生物群體共同作用有效分解有機物的動態(tài)生化過程[9]。目前，有關(guān)于雙孢菇培養(yǎng)料（主要是麥稈）發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[10]，還有針對豬糞堆肥[11]、污泥[12]、生活垃圾堆肥[13]等微生物群落的研究，而針對蘆筍老莖堆肥的研究還未見報道。

本試驗對蘆筍老莖堆肥中的嗜熱放線菌進行了初步的分離鑒定研究，旨在為制備蘆筍老莖堆料發(fā)酵菌劑及調(diào)控堆料過程提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 堆肥配方 蘆筍老莖70%，棉籽殼20%，豆餅7.5%，過磷酸鈣1%，石膏粉1%，尿素0.5%（要求蘆筍老莖及其他輔料無霉變，切成20 cm左右的小段，然后將蘆筍老莖浸透水，預(yù)濕后與其他輔料攪拌建堆）。料堆一般底寬120～150 cm，上寬80～90 cm，高80～100 cm。

1.1.2 堆制過程 按2次發(fā)酵法[14-15]發(fā)酵堆料，室外前發(fā)酵18 d，共翻堆4次；移入室內(nèi)進行后發(fā)酵，60℃保持10 h，50℃保持4 d。后發(fā)酵結(jié)束后，調(diào)整培養(yǎng)料的含水量到65%，pH值為7.0～7.5。

1.1.3 采樣 以蘆筍老莖堆肥的堆體四周及中心處為采樣點，采樣深度為20 cm左右，采用四分法采樣。在前發(fā)酵每次翻堆前和后發(fā)酵前后進行采樣，共采6次，即建堆后第4天（A）、第6天（B）、第9天（C）、第11天（D）、第15天（E）和第22天（F），于4℃保存。試驗前將樣品風(fēng)干2 d，放入烘箱，置于120℃下1 h[16-17]。

1.1.4 培養(yǎng)基 高氏Ⅰ號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KNO31 g，K2HPO40.5 g，MgSO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.2～7.4。121℃滅菌20 min。倒平板時，每200 mL培養(yǎng)基添加10 mg的K2Cr2O7[18]作抑菌劑。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離 準(zhǔn)確稱取樣品1 g，加入裝有99 mL無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶中，振蕩約30 min，吸取1 mL樣品懸液加入裝有9 mL無菌水的試管中，吹洗多次，讓菌液混合均勻，即成10-3稀釋液。依此類推，分別制成10-4，10-5稀釋液。分別吸取10-3，10-4，10-5懸液0.2 mL涂布于高氏Ⅰ號平板上，45℃培養(yǎng)3 d，觀察并挑取單菌落，在平板上再劃線純化。將純化后的菌株分別按“樣品編號＋G（代表放線菌）＋數(shù)字”編號。

1.2.2 菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)觀察 平板劃線培養(yǎng)3 d后，觀察菌落的大小、形態(tài)、正反面顏色、厚薄、質(zhì)地、表面狀況及是否產(chǎn)色素。插片培養(yǎng)2 d后，觀察菌絲、孢子絲的形狀和特點。美蘭染色參照文獻[19]。

1.2.2.2 16SrDNA的擴增 選取菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的放線菌菌株通過菌落PCR法[20]提取16SrDNA，擴增引物采用16SrDNA通用引物：27F，5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；1541R，5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR擴增體系：10×TransEasy Taq Buffer 2.5μL，dNTP1μL，引物（20μmol/L）各2.5μL，Trans Easy Taq DNA polymerase 0.5μL，加模板7.5μL，ddH2O補至25μL。各試劑加好后，輕輕混勻。PCR擴增條件：預(yù)變性94℃，5 min；變性94℃，30 s；退火55℃，30 s；延伸72℃，90 s；35個循環(huán)后，72℃保溫10 min。PCR擴增產(chǎn)物和回收產(chǎn)物均經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，UV凝膠成像系統(tǒng)檢測。

1.2.2.3 16SrDNA片段PCR產(chǎn)物的連接、轉(zhuǎn)化、測序 向無菌離心管中加入目的片段16SrDNA回收產(chǎn)物4μL和載體1μL，混勻后于25℃反應(yīng)30 min，4℃反應(yīng)16 h進行連接。將5μL連接產(chǎn)物全部加入感受態(tài)細(xì)胞（100μL）中，溫和混勻，冰浴放置30 min；迅速轉(zhuǎn)入42℃水浴，熱激30 s，再迅速冰浴冷卻2 min后，加入900μL的LB培養(yǎng)基，37℃下90 r/min振蕩培養(yǎng)50 min；然后離心，棄掉大部分上清，剩下的用移液器吹勻，加入10μLIPTG（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）和20μL X-gal（20 mg/mL），混勻后輕輕涂到LB平板（含有氨芐青霉素）；37℃培養(yǎng)12～16 h后可見藍(lán)色菌落。挑取白色菌落接種于LB液體培養(yǎng)基（含有氨芐青霉素），37℃下200 r/min過夜培養(yǎng)；將培養(yǎng)好的菌液分成2管，1管提取質(zhì)粒DNA作酶切篩選用，1管留作測序用。Eco RI限制性內(nèi)切酶酶切篩選：向無菌EP管中依次加入8μL ddH2O，0.5μL Eco R I Buffer，1μL質(zhì)粒DNA，0.5μL Eco R I，于37℃反應(yīng)2 h。反應(yīng)結(jié)束后，產(chǎn)物經(jīng)0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測，含有目的片段重組子的大小共約4 600 bp。選取含目的片段的重組子送華大基因研究中心進行測序。本試驗樣品來自于蘆筍老莖堆肥，克隆編號方法采用“ASC＋重組子號”。

1.2.2.4 菌株16SrDNA序列的同源性分析 將測序獲得的陽性克隆的16SrDNA序列運用CHECK_CHIMERA程序在線進行嵌合體檢驗并去除明顯的Chimera序列。在GenBank數(shù)據(jù)庫中用VECTOR SCREEN程序剔除載體序列，經(jīng)BLAST比對后對菌株進行同源性分析。將獲得的序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中最相似的序列一起使用軟件Clustal X 1.8和MEGA 3.1，采用鄰近法（Neighor Joining），在Kimura雙參數(shù)模型（Kimura 2-parameter）下，繪制相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹和Bootstrap檢驗系統(tǒng)樹，自展值設(shè)為1 000。

1.2.2.5 16SrDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中的登錄號 本研究所獲得16SrDNA序列已提交Gen-Bank數(shù)據(jù)庫，登錄號分別為：JQ358562，JQ358563，JQ358585，JQ358587，JQ358588，JQ358594～JQ35 8596，JQ358598，JQ358599，JQ358602，JQ358607，JQ358565，JQ358567，JQ358569，JQ358572～JQ35 8575，JQ358577，JQ358578，JQ358580，Q358583。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離

采用稀釋涂布法從蘆筍老莖堆肥的6個樣品中分離到菌落形態(tài)有明顯區(qū)別的23個放線菌菌株，其中，A樣品3株，B樣品8株，C樣品1株，D樣品2株，E樣品3株，F(xiàn)樣品6株。編號分別為：AG1～AG3；BG1～BG8；CG1；DG1，DG2；EG1～EG3；FG1～FG6。

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 23株放線菌經(jīng)形態(tài)觀察都屬于鏈霉菌屬（Streptomyces），都有螺旋或（和）波曲形狀的孢子絲；基絲生長良好，多分支，不形成橫隔，也不斷裂。菌落形狀以圓形為主，其中，BG7菌落是無規(guī)則形；菌落正面顏色以不同層次的灰色和黑色為主，其中，BG7和FG5菌落為灰綠色；一般菌落凸起，表面粉粒狀，其中，AG2，BG2，CG1，DG1和EG1菌落表面較平坦?jié)駶櫋?3株鏈霉菌中，有4株產(chǎn)色素，分別是AG2產(chǎn)褐色色素、BG3產(chǎn)醬色色素、EG2和FG4產(chǎn)黃色色素。

2.2.2 16SrDNA的擴增 每株菌取10個單菌落，加1 mL ddH2O煮沸5 min，12 000 r/min離心2 min，取上清液作模板進行PCR擴增。其中，1株放線菌的PCR擴增產(chǎn)物如圖1所示，可見獲得條帶約為1.6 kb的16SrDNA序列。

2.2.3 16SrDNA序列測定和比對 測序后，將23株鏈霉菌的16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已發(fā)表的序列進行比對（表1）。

表1 樣品中的放線菌菌株按照16S rDNA 序列的比對結(jié)果

由表1可知，A樣品3個菌株分別與白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus（GQ925802），熱普通鏈霉菌 Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），Streptomyces sp.（AM889494）的同源性最高；B樣品8個菌株分別與白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus（GQ925802），熱普通鏈霉菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），Streptomyces sp.（HQ596202），假淺灰鏈霉菌Streptomyces pseudogriseolus（X80827），Streptomyces sp.（JF502572），刺棘鏈霉菌Streptomyces espinosus（X80826），Streptomyces sp.（X81574），Streptomyces sp.（GU045531）的同源性最高；C樣品1個菌株與熱普通鏈霉菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405）的的同源性最高；D樣品2個菌株分別與熱普通鏈莓菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus （GQ925802）的同源性最高；E樣品3個菌株分別與熱普通鏈霉菌Streptomyces thermovulgaris（DQ521405），Streptomyces sp.（AM889494），Streptomyces sp.（GU045531）的同源性最高；F樣品6個菌株分別與白淺灰鏈霉菌Streptomyces albogriseolus（GQ925802），Streptomyces sp.（HQ596202），假淺灰鏈霉菌Streptomyces pseudogriseolus（X80827），Streptomyces sp.（AM889494），Streptomyces sp.（DQ092377），Streptomyces sp.（GU045531）的同源性最高。

由測序比對結(jié)果可知，23株鏈霉菌中，4株的序列與白淺灰鏈霉菌的同源性最高，5株的序列與熱普通鏈霉菌的同源性最高，2株的序列與假淺灰鏈霉菌的同源性最高，1株的序列與刺棘鏈霉菌的同源性最高，有11株在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找到與其相似的已知鏈霉菌種的序列，分類地位待定。結(jié)果說明，蘆筍老莖堆肥中優(yōu)勢的嗜熱可培養(yǎng)放線菌主要是白淺灰鏈霉菌和熱普通鏈霉菌。

根據(jù)6個樣品中23株鏈霉菌的16SrDNA序列和同源性最高的已知菌株的序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。

3 討論

本研究在分離嗜熱放線菌時，首先對樣品進行了物理處理，即120℃烘1 h，然后在分離的高氏Ⅰ號培養(yǎng)基中添加抑菌劑，一方面可以促進放線菌孢子的萌發(fā)，另一方面可以除掉大部分的細(xì)菌、真菌。母連軍[16]、司美茹等[21-22]發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)?shù)臒崽幚砜梢源龠M放線菌孢子活化，能有效地提高放線菌的種類和數(shù)量；在分離的培養(yǎng)基中添加化學(xué)抑菌劑或抗生素，也可提高放線菌的出菌量。司美茹等[21]利用9種培養(yǎng)基來分離特殊環(huán)境中的放線菌發(fā)現(xiàn)，高氏Ⅰ號分離得到的放線菌數(shù)量和種類最多。本試驗在分離的過程中，完全沒有細(xì)菌、霉菌的干擾，而且嗜熱放線菌的出菌量較好。

本試驗通過菌落PCR方法，直接煮沸菌體導(dǎo)致細(xì)胞破裂，以暴露出的DNA為模板進行PCR擴增。結(jié)果證明，該方法可以對蘆筍老莖堆肥中分離到的放線菌進行大規(guī)模的鑒定。菌落PCR方法不僅大大減少了工作量，而且提高了試驗效率。從電泳圖上可以看出，菌落PCR還存在著一些非特異性的結(jié)合，可能是因為模板中存在其他蛋白質(zhì)和多糖等雜質(zhì)影響或抑制了擴增反應(yīng)，導(dǎo)致擴增效果不太理想。但是如果用作定性檢測，菌落PCR不僅能得到與常規(guī)PCR相同的結(jié)論，還可以節(jié)省大量的人力和物力，是一種切實可行的檢測方法。

微生物群落及其結(jié)構(gòu)在堆料物質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中起著非常重要的作用，堆料中微生物數(shù)量及種群分布與堆肥中有機物質(zhì)成分和含量、微生物間的相互作用等多種因素密切相關(guān)[9]。本研究結(jié)果表明，蘆筍老莖堆肥中的嗜熱放線菌主要是鏈霉菌，而且?guī)缀醴蛛x到的放線菌都屬于鏈霉菌。23株鏈霉菌中，有11個菌株在GenBank數(shù)據(jù)庫中未找到與其相似的已知菌株的序列，分類地位待定，這為下一步從蘆筍老莖堆肥中篩選分離有價值的新嗜熱可培菌提供了可能。本研究只分離到屬于鏈霉菌屬的嗜熱放線菌，沒有分離到像高溫放線菌（Thermoactinomyces） 和高溫單孢菌（Thermomonospora）等屬的嗜熱放線菌，這可能是因為在蘆筍老莖堆肥過程中起作用的嗜熱放線菌主要是鏈霉菌，也可能是因為選用的高氏Ⅰ號分離培養(yǎng)基不適合其他嗜熱放線菌的生長。在下一步的分離工作中，有必要選擇更多的分離培養(yǎng)基來進行比較研究。

［1］孫春艷，趙伯濤，郁志芳，等.蘆筍的化學(xué)成分及藥理作用研究進展[J].中國野生植物資源，2004，23（5）：1-5.

［2］毛興平，朱志強，張平，等.綠蘆筍采后品質(zhì)變化概述[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，16（4）：123-127.

［3］娜日蘇.石刁柏栽培技術(shù)[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2008（6）：110.

［4］郜春花，盧朝東.山西省蘆筍生產(chǎn)現(xiàn)狀及發(fā)展對策探討[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35（1）：15-18.

［5］申挺挺，郭珺，李欣欣，等.杏鮑菇、白靈菇對蘆筍老莖中木質(zhì)纖維素的分解利用 [J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（11）：1170-1173.

［6］Wang Q，Li B B，Li H.Yield，dry matter and polysaccharides content of themushroom Agaricus blazei produced on asparagus straw substrate[J].Scientia Horticulturae，2010，125：16-18.

［7］Mitali D，Todd V R，Laura G L.Diversity of fungi，bacteria and actinomyceteson leavesdecomposingin astream[J].Applied and Environmental Microbiology，2007，73（3）：756-767.

［8］Xi BD，Liu H L，Zeng GM，et al.Composting MSW and sewage sludgewith effectivecomplex microorganisms[J].Journal of Environmental Sciences，2002，14（2）：264-268.

［9］萬水霞，郭熙盛，朱宏賦，等.自然堆肥過程中微生物群落的動態(tài)變化[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（28）：13710-13711.

［10］何麗鴻，于榮利，陳明杰，等.采用ARDRA研究雙孢蘑菇培養(yǎng)料后發(fā)酵過程中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（Ⅰ）[J].食用菌學(xué)報，2008，15（4）：11-15.

［11］鄧強，楊向科，王慧杰.微生態(tài)調(diào)節(jié)劑對豬糞堆肥過程中微生物群落的影響[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007（8）：75-77.

［12］王春銘，雷恒毅，王國惠，等.城市污泥摸擬堆肥過程中高溫菌群的篩選、鑒定及降解效果 [J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2007，27（6）：979-986.

［13］黨秋玲，劉馳，希北斗，等.生活垃圾堆肥過程中細(xì)菌群落演替規(guī)律[J].環(huán)境科學(xué)研究，2011，24（2）：236-242.

［14］Wuest PJ.Compost and the composting-process[J].Mushroom News，1978，11：25-29.

［15］池致念，王澤生，廖劍華，等.蘑菇培養(yǎng)料集中二次發(fā)酵的初步研究[J].中國食用菌，2002，21（1）：30-32.

［16］母連軍，胡永松，王忠彥.放線菌分離方法的進展[J].四川食品工業(yè)科技，1996（3）：4-6.

［17］李新，紀(jì)明山.土壤中拮抗放線菌的分離和篩選[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（1）：58-60.

［18］馮軼男，楊潤清.放線菌分離與篩選方法的研究進展[J].生物技術(shù)，2010，20（4）：95-98.

［19］沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京：高等教育出版社，2007.

［20］唐曄盛，李英.菌落PCR在大規(guī)模基因組測序中的應(yīng)用[J].生物化學(xué)與生物物理進展，2002，29（2）：316-318.

［21］司美茹，薛泉宏，來航線.放線菌分離培養(yǎng)基篩選及雜菌抑制方法研究[J].微生物學(xué)通報，2004，31（2）：61-65.

［22］宋影，王潮鐘，郭世英.放線菌菌株Ys.03的分離篩選及其抗病毒作用初步研究[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25（6）：164-166.