朱田田，杜 弢，晉 玲，陳紅剛，張延紅，高素芳

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730000；2.甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州730000；3.甘肅中醫(yī)學(xué)院藥用植物遺傳育種研究所，甘肅蘭州730000）

中麻黃（Ephedra intermedia）是被《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的正品麻黃之一[1-2]，具有發(fā)汗解表，宣肺平喘，利水消腫等功效[3]。由于近年來(lái)濫采亂挖現(xiàn)象嚴(yán)重，致使中麻黃野生資源日漸枯竭，地面覆蓋逐年減少，已成為瀕危藥用植物[4]。甘肅省為中麻黃主要分布省份之一，野生資源破壞亦十分嚴(yán)重，年收購(gòu)量由20世紀(jì)80年代的3 000 t減少到目前的不足400 t[5]。因此，中麻黃資源的可持續(xù)性利用和保護(hù)工作勢(shì)在必行。

近年來(lái)，DNA分子標(biāo)記技術(shù)已在藥用植物資源利用與保護(hù)方面得到廣泛應(yīng)用，并成為研究熱點(diǎn)[6-8]，而分子生物學(xué)試驗(yàn)?zāi)芊耥樌M(jìn)行的基礎(chǔ)是能否提取高質(zhì)量的基因組DNA。本研究通過(guò)對(duì)不同方法采集和保存下的中麻黃樣品進(jìn)行基因組DNA提取，并采用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)法對(duì)其完整性、純度以及濃度進(jìn)行比較，旨在確定中麻黃的最佳采集和保存方法，為能夠提取出高質(zhì)量的基因組DNA奠定基礎(chǔ)，為下一步的分子生物學(xué)試驗(yàn)提供可靠保證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試材料為植物中麻黃（E.intermedia）地上草質(zhì)莖，其采集時(shí)間、地點(diǎn)及保存方法如表1所示。所有樣品均由甘肅中醫(yī)學(xué)院中藥資源教研室晉玲副教授鑒定為麻黃科（Ephedrae）植物中麻黃（E. intermedia）。

表1 不同采集及保存方法的中麻黃樣品

1.1.2 儀器設(shè)備 移液槍?zhuān)‥ppendorf），臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（TGL16M），恒溫水浴鍋（HH-S24），凝膠成像系統(tǒng)（BIO-RAD），紫外分光光度計(jì)（UV-1102），電泳儀（DYY-7），渦旋混合儀（WH-3）。

1.1.3 主要試劑 液氮；CTAB，EDTA，Tris，PVP（聚乙烯吡喏烷酮），β-巰基乙醇，均購(gòu)于西安科昊生物工程有限責(zé)任公司；RNaseA，瓊脂糖（Agarose），EB，均購(gòu)于蘭州科美特生物科技有限公司；其余試劑（異丙醇、氯仿、異戊醇、無(wú)水乙醇、氯化鈉、乙酸鈉）均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 改良CTAB法[9-15]（1）稱(chēng)取0.1 g左右中麻黃植物組織置于潔凈干燥研缽中，加入適量PVP后與液氮研成細(xì)粉，在解凍前迅速轉(zhuǎn)至2 mL離心管中。（2）加入800μLCTAB提取緩沖液（2%CTAB，20 mmol/LEDTA（pH值8.0），100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0），1.4 mol/L NaCl，2%β-巰基乙醇），渦旋混勻后放入65℃水浴中溫浴50 min，期間每隔15 min顛倒混勻一次。（3）冷卻至室溫后加入等體積氯仿/異戊醇（24∶1），輕輕顛倒混勻后靜置5 min，12 000 r/min離心10 min，用切尖槍頭仔細(xì)吸取上清液于新離心管中，重復(fù)此步驟2～3次，直到分界層無(wú)白色物質(zhì)為止。（4）吸取上清液于新離心管中，加入4μL RNaseA（10 mg/mL），37℃溫浴1 h；加入2/3體積的異丙醇，1/10體積的5 mol/L乙酸鈉輕輕混勻，于-20℃放置30 min沉淀DNA；12 000 r/min離心10 min，小心倒掉上清液，保留DNA沉淀于管底，加入70%乙醇700μL洗滌沉淀2～3次。（5）室溫干燥后加入130μLTE緩沖液溶解DNA沉淀并且保存于4℃冰箱中備用（-20℃進(jìn)行長(zhǎng)期保存）。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA完整性 取5μL基因組DNA樣品與1μL上樣緩沖液混勻后點(diǎn)樣于0.8%瓊脂糖凝膠孔，電泳緩解液為1×TBE溶液，電壓80 V條件下電泳1 h左右，EB（10 mg/mL）染色20 min，用凝膠成像系統(tǒng)照相，保存。

1.2.3 紫外分光光度計(jì)法檢測(cè)基因組DNA的純度和濃度 取20μL DNA樣品用無(wú)菌ddH2O稀釋20倍，混合均勻后加入石英比色皿中，測(cè)定260，280 nm波長(zhǎng)處的紫外吸收值。根據(jù)A260/A280的值判斷總DNA純度，并計(jì)算質(zhì)量濃度。DNA質(zhì)量濃度（μg/mL）＝A260×稀釋倍數(shù)×50。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 電泳檢測(cè)結(jié)果

不同采集和保存方法提取的中麻黃基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，不同采集和保存方法的中麻黃樣品的基因組DNA提取效果存在明顯差異，1，2號(hào)樣品條帶整齊、明亮且拖尾不太明顯，說(shuō)明新鮮樣品在采集后迅速冷凍保存，其基因組DNA降解較少，提取效果好；3，4，5，6號(hào)樣品條帶清晰、整齊且無(wú)拖尾，但明亮度較1，2號(hào)差，說(shuō)明采集的鮮樣無(wú)論置于液氮中或放入硅膠迅速干燥后冷凍保存，均能提取出高質(zhì)量的基因組DNA且無(wú)降解，但提取量相對(duì)較少；7，8號(hào)樣品條帶有拖尾，說(shuō)明采集的鮮樣在陰干幾天后冷凍保存會(huì)導(dǎo)致基因組DNA降解，影響提取質(zhì)量；9，10號(hào)樣品條帶比較淡，且有明顯拖尾，說(shuō)明陰干后在室溫下保存的樣品，基因組DNA降解非常嚴(yán)重，提取的量少且質(zhì)量不佳。

2.2 基因組DNA 紫外分光光度計(jì)檢測(cè)結(jié)果

由表2可知，1，2號(hào)樣品的A260/A280低于1.7，說(shuō)明采集后迅速冷凍保存的新鮮樣品所提取的基因組DNA有蛋白質(zhì)、多酚雜質(zhì)的污染；3，4，6號(hào)樣品的A260/A280在1.7～1.8之間，說(shuō)明置于液氮中或放入硅膠迅速干燥后冷凍保存的樣本所提取的基因組DNA較純凈，基本無(wú)蛋白質(zhì)、多糖或RNA的污染；而5號(hào)樣品比值大于1.9，說(shuō)明該樣品的RNA未除干凈；7，8，9，10號(hào)樣品的A260/A280均未達(dá)到1.7，有的甚至低于1.5，說(shuō)明采集的鮮樣在陰干幾天后無(wú)論是冷凍保存還是室溫保存都會(huì)影響其提取效果，使得蛋白質(zhì)或酚類(lèi)雜質(zhì)不易除凈。因此，新鮮植物樣本在采集時(shí)置于液氮或硅膠中保存，可有效防止DNA降解，且這2種方法對(duì)提取質(zhì)量的影響差別不大。

表2 提取的基因組DNA 純度及濃度檢測(cè)

3 討論

基因組DNA的有效提取是進(jìn)行任何DNA下游工作的前提和基礎(chǔ)，有效提取指的是得到的基因組DNA（或稱(chēng)總DNA）有足夠的量，盡可能少降解和不含有影響下一步酶反應(yīng)的雜質(zhì)，因此，在DNA提取過(guò)程中應(yīng)盡量避免使DNA斷裂和降解的各種因素，以保證DNA的完整性，為后續(xù)的試驗(yàn)打下基礎(chǔ)[16]。

植物材料的DNA降解速度與其新鮮程度有極大關(guān)系，如果材料不新鮮或反復(fù)凍融，其內(nèi)源核酸酶的活性未很好抑制，降解速度會(huì)加快；同時(shí)，由于低溫可以抑制相關(guān)酶的活性，使DNA降解速度減慢，因此，在植物樣品采集時(shí)，常采用液氮保存材料，以保持其材料的新鮮度。由于液氮不便于攜帶且具有揮發(fā)性，因此，在較遠(yuǎn)地區(qū)或者時(shí)間較長(zhǎng)的采樣時(shí)，液氮保存具有一定的困難。有研究表明，野外采集時(shí)可將新鮮葉片或芽等用變色硅膠快速干燥，可有效防止細(xì)胞死亡過(guò)程中次生物質(zhì)的釋放和DNA的原位降解，因此，對(duì)DNA質(zhì)量無(wú)影響，同時(shí)又可以解決攜帶不方便及采樣量大的問(wèn)題[17-18]。本試驗(yàn)中，通過(guò)比較以上2種采集保存方法的DNA提取效果，發(fā)現(xiàn)二者無(wú)論從DNA的完整性還是純度與濃度上差別都不大，與前人的研究結(jié)果一致。

由于中麻黃多生長(zhǎng)在氣候干旱的荒漠地區(qū)，使得其地上莖木質(zhì)化，可以有效地防止組織或細(xì)胞失水，延長(zhǎng)了其脫離母體后的保鮮時(shí)間，減緩了DNA的降解速度。本試驗(yàn)采自興隆山和仁壽山的樣品，由于其采集地距實(shí)驗(yàn)室不遠(yuǎn)，采樣后并未做任何處理，在當(dāng)天直接帶回實(shí)驗(yàn)室，因此，其降解程度并不嚴(yán)重。此外，植物材料無(wú)論以何種方式采集保存，都必須在低溫環(huán)境下長(zhǎng)期存放，否則會(huì)造成DNA迅速降解，本試驗(yàn)研究結(jié)果也支持此觀點(diǎn)。

植物基因組DNA提取質(zhì)量不僅與樣品的采集和保存方法有關(guān)，還與植物組織新鮮度、提取方法以及操作過(guò)程相關(guān)。因此，在植物基因組DNA提取過(guò)程中要綜合考慮上述因素，才能得到高質(zhì)量的基因組DNA，為后續(xù)分子生物學(xué)試驗(yàn)提供可靠保證。

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