辛玲歌 張 旋 張媛媛 陜西中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院（咸陽712000）

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）又稱退行性關(guān)節(jié)病，是以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為病理特征的疾病，是多見于中年以后的慢性進行性關(guān)節(jié)疾患。據(jù)調(diào)查，目前骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率逐年增高，卻沒有較理想的治療手段，因此探尋一種有效、簡便、安全、經(jīng)濟的膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎治療方法是必要的?！帮L濕骨痹口服液”是根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論和長期實踐積累，經(jīng)反復臨床驗證總結(jié)出的具有滋補肝腎、活血祛瘀、溫經(jīng)止痛的純中藥復方制劑。它由杜仲、淫羊藿、黃芪、熟地黃、續(xù)斷、菟絲子、威靈仙、牛膝、丹參等16味中藥材組成。通過臨床驗證，療效確切。為了控制該制劑的質(zhì)量，筆者采用薄層色譜法（TLC）對處方中的黃芪、熟地黃、甘草進行薄層色譜鑒別，采用高效液相色譜法測定“風濕骨痹口服液”中原兒茶醛的含量并進行方法學考察，為臨床應用提供科學依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材 料 1.1 藥品 風濕骨痹口服液，陜西中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)（批號：20110505；20110507；20110509）黃芪甲苷對照品（編號：110781－200613；供含測用，由中國藥品生物制品鑒定所提供）；熟地黃對照藥材（編號：121196－200804，由中國藥品生物制品鑒定所提供）；甘草對照藥材（編號：0904－200108，由中國藥品生物制品鑒定所提供）；原兒茶醛對照品（編號：110810－201007，由中國藥品生物制品檢定所提供），甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，其它試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備 日本日立高效液相色譜儀、L－2455二極管陣列檢測器、L－2130四元泵、L－2200自動進樣器、L－2300柱溫箱、L－2000色譜數(shù)據(jù)工作站；日本島津電子天平AUW120D。

2 方 法 2.1 薄層色譜鑒別 2.1.1 黃芪［1，2］取本品20mL，用水飽和的正丁醇提取三次，每次5mL，合并正丁醇液，以1%氫氧化鈉溶液洗滌2次，每次5mL，棄去洗液，正丁醇液水浴蒸干，殘渣加稀乙醇1mL 使溶解，加在中性氧化鋁柱（100～120目，2g，內(nèi)徑為1～1.5cm）上，用40%乙醇50mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加水1mL 使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.2～1.5cm，柱高為12cm），依次用水20mL、40%乙醇30mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70%乙醇50mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇1mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取上述兩種溶液各2μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水（13：7：2）10℃以下放置后的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液（1→10），105℃加熱至斑點顯色清晰，置日光和紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，日光下顯相同顏色的斑點；紫外光下顯相同顏色的熒光斑點。結(jié)果見圖1。

圖1 黃芪TLC圖（365nm）

2.1.2 熟地黃［1，3］取本品10mL，加水20mL，搖勻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，揮干，殘渣加甲醇2mL使溶解，作為供試品溶液。另取熟地黃對照藥材4g，加水50mL，煎煮30min，濾過，濾液與供試品同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗，吸取以上兩種溶液各5μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二甲苯－乙酸乙酯（1：1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以二硝基苯肼乙醇試液。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖2

圖2 熟地黃TLC圖

2.1.3 甘草［1，4］取本品20mL，用乙醚振搖提取2次，每次20mL，棄去乙醚液，水溶液用水飽和的正丁醇提取3次，每次20mL，合并正丁醇液，用水洗滌3次，每次20mL，棄去洗液，正丁醇液蒸干，殘渣加乙醇2mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘草對照藥材1g，加水50mL煎煮30min，濾過，濾液與供試品同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB試驗吸取上述兩種溶液各5μL分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯－甲酸－冰醋酸－水（15：1：1：2）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸試液，加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結(jié)果見圖3。

圖3 甘草TLC圖

2.2 含量測定［5］2.2.1 色譜條件 kromasil C18色譜柱（4.6mm×200mm，5μm）；甲醇－水－冰醋酸（10：87：1）為流動相；流速1.0mL·min－1；柱溫為室溫；檢測波長278nm。進樣量10μL；在上述的色譜條件下原兒茶醛完全達到基線分離。與鄰峰分離大于1.5，按原兒茶醛峰計算理論板數(shù)均在3000以上。

2.2.2 檢測波長的選擇 根據(jù)原兒茶醛的紫外線吸引圖譜，原兒茶醛的最大吸引波長為278nm，故我們選用278nm 作為檢測波長。通過研究，在此波長處測定雜峰干擾小。

2.2.3 對照品溶液的制備 精密稱取原兒茶醛對照品適量，加甲醇制成每1mL 含0.0213mg的溶液，即得。

2.2.4 供試品溶液的制備 精密量20110505批次風濕骨痹口服液20mL，加水20mL，搖勻，用乙酸乙酯振搖提取4次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，用水洗滌2次，每次15mL，棄去水洗液，乙酸乙酯液置水浴上蒸干，殘渣用甲醇適量溶解，轉(zhuǎn)移至50mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2.5 陰性干擾試驗 按處方中各味藥比例稱取適量，按工藝及制法制成缺丹參的空白樣品，同供試品溶液制備方法制得空白對照溶液，進樣。結(jié)果空白對照溶液在與對照品溶液色譜保留時間相應的位置上無其它色譜峰出現(xiàn)，說明其它成份對原兒茶醛無干擾。結(jié)果見圖4

圖4 風濕骨痹口服液高效液相色譜圖

2.2.6 線性關(guān)系的考察 精密吸取對照品（濃度0.0213mg／mL）2，5，7.5，10，12.5，15μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件注入色譜儀，測定峰面積。以原兒茶醛峰面積（Y）對進樣濃度（X）進行回歸，得回歸方程：Y＝1998.5X－2350.8，R2＝0.9999，線性范圍42.6μg～319.5μg。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批供試品（產(chǎn)品批號：20110505）溶液，分別在0、1、4、8、12h注入液相色譜儀測定一次峰面積，結(jié)果RSD%＝1.67，表明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.8 精密度試驗 取對照品溶液（20.3μg·mL－1）溶液各10μL，連續(xù)5次注入液相色譜儀測定峰面積，結(jié)果RSD＝0.32%，說明儀器的精密度較好。

2.2.9 重現(xiàn)性試驗 同一批供試品（20110505）6份按正文含量測定方法測定，RSD＝0.59%，說明方法的重現(xiàn)性好。

2.2.10 回收率試驗 精密稱取原兒茶醛對照品適量，加入已知含量的樣品（約為測定方法中樣品的十分之一）中，按正文含量測定方法測定，計算回收率，結(jié)果見表1。說明本方法回收率較好，方法可行。

表1 回收率試驗結(jié)果

2.2.11 樣品測定 取3批樣品，分別制備樣品溶液，進行測定，以外標法計算。測定結(jié)果見表2。

表2 三批樣品測定結(jié)果

3 討 論 風濕骨痹口服液是由杜仲、淫羊藿、黃芪、熟地黃、續(xù)斷、菟絲子、威靈仙、牛膝、丹參等十六味中藥制成的口服制劑。具有滋補肝腎、活血祛瘀、溫經(jīng)止痛之功效。用于痹癥膝骨性關(guān)節(jié)炎等證的治療。由于本制劑是復方制劑，藥物多，有效成分復雜，質(zhì)量標準控制指標一直是質(zhì)控中的難點，使其臨床應用受到很大限制，為此我們需要對其進行質(zhì)量標準的研究。在研究過程中，我們對風濕骨痹中十六味藥物進行篩選，用薄層色譜法對黃芪、熟地黃、甘草進行定性鑒別，結(jié)果供試品與對照品相應的位置上有相同的斑點，陰性對照品無干擾，方法具有專一性。采用高效液相色譜法測定口服液中原兒茶醛的含量，分離度好、精密度高、重現(xiàn)性好、陰性無干擾。因此對通過“風濕骨痹口服液”中有效物質(zhì)定性鑒別和含量測定及方法學考察的研究，說明此方法結(jié)果可靠，重現(xiàn)性好，可用于“風濕骨痹口服液”質(zhì)量的控制。

［1］ 國家藥典委員會中華人民共和國藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB.

［2］ 田繼義，羅紅鎖.益氣養(yǎng)血口服液的薄層鑒別研究［J］.陜西中醫(yī)，2009，30（10）：1399－1400.

［3］ 王孟良，趙佳麗.寧神補心片質(zhì)量標準研究［J］.藥物鑒定，2011，20（16）：42－44.

［4］ 江 文，王 斌.抗心衰口服液的質(zhì)量標準研究［J］.江蘇中醫(yī)藥，2011，43（11）：70－71.

［5］ 陳艷霞.HPLC法測定丹參通脈口服液中原兒茶醛的含量［J］.中國藥師，2009，12（9）：1268－1270.