孫穎穎, 王 輝

(1. 淮海工學院 江蘇省海洋生物技術重點實驗室, 江蘇 連云港 222005; 2. 北京市醫(yī)療器械檢驗所, 北京 101111)

海洋微藻在生長過程中會不斷向外分泌黏性物質, 稱為胞外產物(Extracellular products, ECP)[1]。胞外多糖(Extracellular polysaccharides, ECPS)是胞外產物的主要組成成分, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)的微食物鏈及微生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[2]。研究表明, 微藻胞外多糖具有抗腫瘤、抗病毒、抗輻射和免疫調節(jié)等生理活性[3-6]。例如, 黃鍵等[3]指出, 紫球藻(Porphyridium cruentum)胞外多糖在體外具有抗乙肝病毒作用。王大志等[4]指出, 爪哇曲殼藻亞縊變種(Achnanthes javanicavarsubconstricta)、咖啡形雙眉藻 (Amphora coffeaeformis)和多枝舟形藻(Navicula ramosissima)胞外多糖具有抗病毒VHSV 和ASFV活性。Sogawa等[5]發(fā)現(xiàn)一種浮游硅藻具有抗腫瘤K-562細胞活性。Umemura等[6]發(fā)現(xiàn)裸甲藻(Gymnodiniumsp.)多糖具有免疫調節(jié)作用。目前, 某些微藻胞外多糖的抗氧化活性也被報道[7-10]。石全見等[7]指出紫球藻胞外多糖具有清除超氧陰離子(O2·ˉ)和羥基自由基(·OH)的能力, 對它們的半抑制率IC50分別為0.114 g/L和0.619 g/L。朱勁華等[8]指出硒化紫球藻胞外多糖在實驗設定的較低濃度范圍內具有抗氧化活性。薔薇藻(Rhodella reticulata)[9]和裂壺藻(Schizochytriumsp.)[10]等2種海洋微藻的胞外多糖能有效清除·OH、O2·ˉ和過氧化氫(H2O2)等活性氧。

前期研究發(fā)現(xiàn), 球等鞭金藻(Isochrysis galbana)有較高含量的胞外多糖(ECPS), 可達藻細胞干質量的30%[11]。采用離子交換柱層析和凝膠柱層析等分離技術進行了純化, 制備到一種胞外純多糖, 記為ECPSⅢ。在此基礎上, 本文通過測定胞外純多糖ECPSⅢ對O2·ˉ、·OH和H2O2等活性氧的清除以及還原力, 研究了其體外抗氧化活性; 同時, 通過測定ECPSⅢ中的硫酸基和糖醛酸的含量, 初步分析了其理化性質, 以期為球等鞭金藻胞外多糖的開發(fā)應用提供理論依據(jù)和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

球等鞭金藻胞外純多糖ECPSⅢ為白色粉末狀固體, 由江蘇省海洋生物技術重點實驗室制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 球等鞭金藻胞外多糖對超氧陰離子的清除作用

采用鄰苯三酚自氧化體系產生超氧陰離子[12]。反應體系為3.0 mL的Tris-HCl緩沖液(50 mmol/L, pH 8.2), 其中含有3 mmol/L鄰苯三酚, 以及不同濃度的多糖樣品溶液(0.05～1.6 g/L, 分別為0.05、0.1、0.2、0.4、0.8和1.6 g/L, 下同)。在325 nm波長測定反應液吸光度的變化速率。抑制率(%) = (A-B)/A× 100,A為對照組吸光度的變化速率,B為樣品組吸光度的變化速率。

1.2.2 球等鞭金藻胞外多糖對羥基自由基的清除作用

在Smirnoff等方法[13]的基礎上, 加以改進, 測定對羥基自由基的清除作用。在3 mL 150 mmol/L的磷酸緩沖液(pH 7.4)中含有10 mmol/L FeSO4, 2 mmol/L水楊酸鈉, 6 mmol/L H2O2以及不同濃度的多糖樣品溶液(0.05～1.6 g/L, 同上)。37℃下反應1 h, 測定510 nm處的吸光度。抑制率(%)= [1 -(Asample-Asampleblank)/Acontrol] × 100,Acontrol為對照組的吸光度值,Asample為樣品組的吸光度,Asampleblank為樣品空白的吸光度。

1.2.3 球等鞭金藻胞外多糖對H2O2的清除作用

采用分光光度法測定多糖對H2O2的清除作用[14]。多糖樣品溶解在3.4 mL 的PBS中(pH 7.4), 再加入0.6 mL40 mmol/L H2O2, 搖勻后, 在室溫下反應10 min, 在230 nm處測定吸光度。抑制率(%)= [1 -(Asample-Asampleblank)/Acontrol] × 100,Acontrol為對照組的吸光度,Asample為樣品組的吸光度,Asampleblank為樣品空白的吸光度。

1.2.4 球等鞭金藻胞外多糖的還原力

[15]方法, 測定多糖還原力。0.5 mL不同濃度的多糖樣品溶液, 1.25 mL PBS(pH 6.6, 0.2 mol/L)溶液以及10 g/L K3Fe(CN)6溶液1.25 mL, 50℃下反應20 min。然后, 加入100 g/L TCA1.25 mL, 6 000 r/min離心10 min。2.5 mL上清液與0.25 mL新配制的1 g/LFeCl3混合, 搖勻后, 在700 nm處檢測反應體系溶液的吸光度, 溶液的吸光度增加說明樣品的還原力增強。

1.2.5 球等鞭金藻胞外多糖的硫酸基測定

采用硫酸比濁法[16]檢測, 由標準硫酸鹽作參比繪制標準曲線。

1.2.6 球等鞭金藻胞外多糖的糖醛酸測定

采用硫酸-咔唑法[17]測定, 以葡萄糖醛酸作參比繪制標準曲線。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5軟件包進行獨立樣本檢驗統(tǒng)計分析,P＜ 0.05為顯著性差異,P＜ 0.01為極顯著性差異。

2 結果和分析

2.1 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對超氧陰離子的清除作用

由圖1可以看出, 在濃度0.05～1.6 g/L范圍內, ECPSⅢ對超氧陰離子的清除率隨多糖濃度升高而顯著(P＜ 0.05)增強。當濃度為1.6 g/L時, 抗壞血酸(Vc)和ECPSⅢ對超氧陰離子的清除率分別為52.7%和48.5%。在實驗設定濃度范圍內, ECPSⅢ對超氧陰離子的清除作用與Vc接近。

圖1 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對超氧陰離子的清除作用 Fig. 1 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against superoxide radical with ascorbic acid applied as a positive control

2.2 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對羥基自由基的清除作用

圖2表明, 隨著多糖濃度的升高, ECPSⅢ對羥基自由基的清除作用顯著(P＜ 0.05)增強。當濃度為1.6 g/L時, ECPSⅢ對羥基自由基的清除率分別達到63.6%。Vc濃度為0.8 g/L時, 其對羥基自由基的清除率為64.2%, 這表明, ECPSⅢ具有中等清除羥基自由基的能力。

2.3 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對H2O2的清除作用

在圖3中, 當多糖濃度從0.05增加至1.6 g/L時, ECPSⅢ對H2O2的清除率從7.76%升至49.8%, 其對H2O2的清除作用隨多糖濃度的升高而顯著(P＜ 0.05)增強。在實驗設定濃度范圍內, ECPSⅢ對H2O2的清除作用顯著(P＜ 0.05)低于Vc對H2O2的清除作用。

圖2 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對羥基自由基的清除作用 Fig.2 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against hydroxyl radical with ascorbic acid applied as a positive control

圖3 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ對過氧化氫的清除作用 Fig.3 Scavenging activity of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana against hydrogen peroxide with ascorbic acid applied as a positive control

2.4 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的還原力

隨著多糖濃度的升高, ECPSⅢ的還原力顯著 (P＜ 0.05)增加。在實驗設定濃度范圍內, Vc對赤血鹽溶液的還原作用顯著(P＜ 0.05)高于ECPSⅢ對赤血鹽溶液的還原作用(圖4)。

2.5 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的硫酸基和糖醛酸含量

硫酸基標準曲線為,y= 5.1419x-0.0306 (R2= 0.9881), 其中,x為硫酸基質量(mg),y為A530。

葡萄糖醛酸的標準曲線為,y= 5.1419x-0.0306 (R2= 0.9818), 其中,x為葡萄糖醛酸質量(mg),y為A360。

通過計算, 得到ECPSⅢ中硫酸基和糖醛酸含量, 分別為76.90 mg/g和17.1%。

圖4 球等鞭金藻胞外多糖ECPSⅢ的還原力 Fig. 4 Total reductive potential of extracellular polysaccharide ECPS III from Isochrysis galbana with ascorbic acid applied as a positive control

3 討論

微藻胞外多糖是微藻在生長代謝過程中分泌到細胞壁外、易與菌體分離的水溶性多糖或多糖復合物, 具有多樣性和復雜性等特點, 并且因為其理化性質獨特, 生物活性優(yōu)良而備受關注。球等鞭金藻富含多不飽和脂肪酸, 蛋白質和多糖[18-20], 是水產養(yǎng)殖業(yè)中常用的餌料微藻。近年來, 隨著微藻多糖研究的深入, 對球等鞭金藻多糖的研究日益增多[18-23]。然而, 相對于其他微藻多糖而言, 球等鞭金藻多糖的研究尚處于起步階段, 尤其是胞外多糖的研究[11,21]。

通過前期研究, 制備到球等鞭金藻胞外純多糖ECPSⅢ。在此基礎上, 本文通過測定ECPSⅢ對O2·ˉ、·OH和H2O2等活性氧的清除作用和還原力, 初步分析了ECPSⅢ的體外抗氧化活性。結果表明, ECPSⅢ具有清除O2·ˉ、·OH 和H2O2的能力, 尤其對O2·ˉ和·OH的清除作用較強。以Vc作為對照, ECPSⅢ具有中高等強度清除O2·ˉ和·OH的能力(圖1、圖2和圖3)。ECPSⅢ具有一定的還原力, 但顯著低于Vc的還原力(圖4)。王凌等將紫球藻胞外多糖進行降解處理, 發(fā)現(xiàn)其降解組分的總還原力與Vc相近, 對O2·ˉ和·OH的清除率可達到94.89%和88.98%[24]。石全見采用降解和衍生化兩種修飾方法處理紫球藻胞外多糖, 制備到一種具有較強抗氧化能力的多糖, 對O2·ˉ和·OH的清除率在70%以上[25]。這些研究表明, 微藻胞外多糖通過某些處理(降解、硫酸酯化和羧甲基化等)可以提高其抗氧化活性。因此, 通過某些處理, 很可能進一步提高ECPSⅢ的抗氧化能力。

同時, 本文還測定了ECPSⅢ中的糖醛酸含量, 為17.1%。梅秋紅等[26]指出銅綠微囊藻胞外純多糖EAPAⅠ的糖醛酸含量為10.74%。林壽[27]認為糖醛酸的存在是酸性多糖具有特殊生理活性的重要原因之一。梅秋紅等[26]發(fā)現(xiàn)銅綠微囊藻胞內多糖的糖醛酸含量高于其胞外多糖的糖醛酸含量, 為12.75%。他們指出胞內多糖的酸性較胞外多糖更強, 從而可能導致它們的生物學效應有所區(qū)別。硫酸基也是微藻多糖具有生物活性和生理功能的主要官能團[28,29]。石全見等[25]發(fā)現(xiàn)不同硫酸基含量的多糖抗氧化能力存在明顯差異, 隨著硫酸基含量增大, 多糖抗氧化能力增強。本研究中, ECPSⅢ中硫酸基含量為76.90 mg/g, 銅綠微囊藻胞外純多糖EAPAⅠ的硫酸基含量為44.44 mg/g[26], 新月菱形藻和紫球藻胞外多糖的硫酸基含量不超過4%[30-31]。上述結果表明, ECPSⅢ中硫酸基和糖醛酸含量較高。

球等鞭金藻是一種已經(jīng)實現(xiàn)大規(guī)模養(yǎng)殖的海洋微藻, 在培養(yǎng)過程中能產生含量豐富的胞外多糖[21], 并且胞外多糖中酸性多糖的含量顯著高于中性多糖的含量。同時, 本文結果表明, 胞外純多糖具有一定的抗氧化活性, 還富含硫酸基和糖醛酸。這就表明, 球等鞭金藻胞外多糖具有廣闊的應用前景。

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