武密山， 趙素芝， 任立中， 王 茹， 白 霞， 韓紅偉， 李 彬

(1河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院方劑學(xué)教研室，河北 石家莊050091;2石家莊市橋東區(qū)勝北社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心，河北石家莊050041;3河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院骨科，河北 石家莊050031;4 河北醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室，河北 石家莊050017)

研究表明，密骨打老兒丸(Migu-Dalaoer pill，MDP)能抑制由去卵巢、雌激素缺乏引發(fā)的骨轉(zhuǎn)換增強(qiáng)，提高骨密度，糾正失衡的骨偶聯(lián)［1］。考慮到骨代謝是成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)共同生活在一起的整體，OB 和OC 間的信息交流是影響骨代謝調(diào)控的重要環(huán)節(jié)，二者之間的信息交流對彼此功能的影響是骨代謝的重要方面，用MDP 含藥血清對單純成骨細(xì)胞干預(yù)實驗并不能代表MDP 對骨代謝調(diào)控的真實情況，本實驗設(shè)計更符合骨代謝微環(huán)境的成骨-破骨細(xì)胞共育體系，并用MDP 含藥血清進(jìn)行了干預(yù)，現(xiàn)將結(jié)果報告如下。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 清潔級10 月齡雌性SD 大鼠40 只，體重(351.36 ±12.35)g ，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為2011A018。普通級1 日齡SD新生大鼠，由河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號為2011B025。

1.2 藥物 打老兒丸來源于《萬氏家抄方·卷四》，組成是:石菖蒲、干山藥、川牛膝、遠(yuǎn)志、巴戟天、川續(xù)斷、五味子、楮實子、杜仲、山萸肉、茯神、熟地黃、小茴香、肉蓯蓉、枸杞子各等分。打老兒丸加上具有促進(jìn)成骨作用的淫羊藿［2］、骨碎補(bǔ)［3］、補(bǔ)骨脂［4］、菟絲子各等分，按照參照文獻(xiàn)［1］，制備MDP，每1 mL 藥液含生藥5.5 g，相當(dāng)于臨床用量的20 倍。

1.3 主要試劑 胰蛋白酶(Sigma)，collagenase typeⅡ(Worthington)，噻唑藍(lán)、堿性磷酸酶(alkaline phosphate，ALP)試劑盒(Wako);DMEM 培養(yǎng)基(Gibco)，胎牛血清(HyClone)，α-minimal essential medium(α-MEM，Gibco)，二甲基亞砜(DMSO)購自 Sigma Chemical Co，抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)試劑盒(Sigma)，戊二醛、甲苯胺藍(lán)為E. Merck 產(chǎn)品。其余普通試劑均為分析純。

1.4 主要儀器 倒置相差顯微鏡(Olympus)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(NuAire)，96 孔培養(yǎng)板(Costar)，35 mm 組織培養(yǎng)皿(Corning)，紫外可見分光光度計(HP 8453);低溫臺式離心機(jī)(IEC)，可調(diào)式移液器(Eppendorf)，全自動酶標(biāo)儀(Biohit)，D-37520 型高速冷凍離心機(jī)(Beckman)，0.22 μm 針式濾器(Costar)，Leitz 1600 型鋸式切片機(jī)(Leica)，SB-3200D 超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)，XDS-1B型倒置相差顯微鏡(重慶光學(xué)儀器廠)。

2 方法

2.1 大鼠血清的制備 40 只10 月齡大鼠，隨機(jī)分為2 組:(1)服藥組:按1 g·kg-1灌服MDP，每天1次，連續(xù)3 d;(2)對照組:只灌服相同體積的生理鹽水。第3 次灌胃1.5 h 后，所有大鼠均在乙醚麻醉下自腹主動脈抽取血液，同組合并后離心獲取血清，血清在56 ℃滅活30 min，0.22 μm 濾膜過濾除菌后備用。參照本實驗室方法［5］，制備0.1 μmol·L–1、1 μmol·L–1和10 μmol·L–1(低、中、高劑量)的MDP 含藥血清和生理鹽水對照血清。

2.2 骨片的制備 參照文獻(xiàn)［6］，將新鮮牛股骨用金剛砂片及粗細(xì)金鋼砂石制備成6 mm ×6 mm 大小，10 μm 厚的骨磨片，超聲清洗2 次，各10 min，置入含1 ×106U/L 青霉素和1 g/L 鏈霉素的D-Hanks 緩沖液中浸泡，換液3 次，每次20 min。

2.3 OB 的分離與培養(yǎng) 取孕齡22 d SD 大鼠1只，處死后無菌操作取出14 只胎鼠的顱骨，參考Brighton 等［7］介紹的分段膠原酶消化法進(jìn)行成骨細(xì)胞的分離。

2.4 OC 的分離與培養(yǎng) 參照文獻(xiàn)［8］，應(yīng)用改良Fenton 等的方法，由1 日齡SD 大鼠四肢長骨分離OC。

2.5 成骨- 破骨細(xì)胞共育體系的建立 參照文獻(xiàn)［9-10］，對96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板進(jìn)行改裝(圖1)。即在距培養(yǎng)孔底部2 mm 處打孔(直徑4 mm)，使相鄰的4 孔相通，中間加一層0.45 μm 的隔膜，膜與培養(yǎng)板接觸處用3%瓊脂糖凝膠密封，防止左右兩室的細(xì)胞混雜，但培養(yǎng)上清可以經(jīng)過隔膜相通。將制備好的培養(yǎng)板置于紫外線燈下照射消毒，備用。將OB 以5×103密度接種到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板的OB 培養(yǎng)室，3 h 后細(xì)胞已牢固貼于孔底;在培養(yǎng)板的OC 培養(yǎng)室中加入密度為5 ×103的新分離的OC，30 min 后可見細(xì)胞沉入孔底;小心加入培養(yǎng)基，漫過通道孔，使兩側(cè)培養(yǎng)上清相通;每4 h 將培養(yǎng)板傾斜5 次，促進(jìn)雙側(cè)上清交流。待細(xì)胞周期同步化后，按實驗要求進(jìn)行培養(yǎng)。

Figure 1. Osteoblast and osteoclast co-culture system.圖1 成骨細(xì)胞－破骨細(xì)胞共育體系示意圖

2.6 血清干預(yù)方法與分組 待上述成骨-破骨細(xì)胞共育體系的細(xì)胞周期同步化后，實驗共分4 組，分別為:對照組(normal，加入相同質(zhì)量濃度的對照大鼠血清)、MDP 含藥血清低劑量組(L-MDP，加入0. 1 μmol·L–1MDP 含藥血清)、MDP 含藥血清中劑量組(M-MDP，加入1 μmol·L–1MDP 含藥血清)和MDP 含藥血清高劑量組(H-MDP，加入10 μmol·L–1MDP 含藥血清)，不同濃度培養(yǎng)組，每組藥物濃度均設(shè)10 個平行孔，每孔加入相應(yīng)DMEM 培養(yǎng)液200 μL 予以培養(yǎng)，每隔2 ～3 d 換液1 次。

2.7 MTT 法繪制OB 增殖生長曲線 將上述共育體系中OB 培養(yǎng)室的OB 分別于4、5、6、7 d 用0.25 g·L-1胰蛋白酶消化，1 ×108L-1接種于96 孔板，每天各取10 孔計數(shù)，每孔計數(shù)5 次，計算均值，連續(xù)4 d。以培養(yǎng)時間為橫軸，細(xì)胞數(shù)為縱軸，描繪生長曲線。計算群體倍增時間(doubling time，TD):TD=t ×log2 /(logNt-logN0)，N0和Nt分別代表接種后和培養(yǎng)t h 的細(xì)胞數(shù)。

2.8 OB 內(nèi)ALP 活性測定 將上述共育體系中OB培養(yǎng)室的OB 分別于4、5、6、7 d 進(jìn)行ALP 檢測。方法如下:每天于同一時點取每個實驗組10 個復(fù)孔，吸盡培養(yǎng)液，PBS 溶液洗3 次，每孔加入0. 2 %Triton X-100 100 μL，振蕩30 min 后再加入反應(yīng)液100 μL，37 ℃孵育30 min，最后每孔加入0.2 mol ·L-1NaOH 50 μL，終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀405 nm 波長下檢測各孔的吸光度，每組取樣本值的均數(shù)繪制各組ALP 隨時間變化的曲線。

2.9 OC 骨吸收陷窩的計數(shù) 在上述共育體系中OC 培養(yǎng)室中加入吸附OC 骨磨片，小心加入培養(yǎng)基，漫過通道孔，使兩側(cè)培養(yǎng)上清相通;每4 h 將培養(yǎng)板傾斜5 次，促進(jìn)雙側(cè)上清交流。分別于4、5、6、7 d 計數(shù)每個骨磨片上吸收陷窩數(shù)目。方法如下:取出骨磨片，2.5% 戊二醛固定液中于4 ℃固定7 min ，然后在0.25% NH3·H2O 溶液中超聲清洗1 min，共3次，經(jīng)系列乙醇脫水，自然晾干后，置甲苯胺藍(lán)染液中，室溫下染色3 ～4 min，蒸餾水清洗后于光鏡下對整張骨磨片上的吸收陷窩有專人盲法進(jìn)行計數(shù)。

2.10 OC 內(nèi)TRAP 活性檢測 將上述共育體系中OC 培養(yǎng)室的OC，分別于4、5、6、7 d 按照試劑盒說明進(jìn)行TRAP 活性檢測。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean ±SD)表示。使用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件，用方差分析處理，組間比較用單因素方差分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB 增殖的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OB 的生長曲線無顯著差異(P ＞0. 05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OB 的生長曲線在6 和7 d 與同一時段對照組相比較明顯升高(P ＜0.01 )，見圖2。

Figure 2. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on osteoblast proliferation rate in osteoblast and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖2 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB 增殖的影響

2 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB ALP活性的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OB 的ALP 活性無顯著差異(P ＞0. 05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OB 的ALP 活性在6 和7 d 與同一時段對照組相比較明顯升高(P ＜0.01)，見圖3。

3 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OC 骨吸收陷窩數(shù)目的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OC 的骨吸收陷窩數(shù)目無顯著差異(P ＞0. 05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OC 的骨吸收陷窩數(shù)目在6 和7 d 與同一時段對照組相比較明顯降低(P ＜0.01)，見圖4。

Figure 3. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on ALP activity of osteoblasts in osteoblasts and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖3 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OB 堿性磷酸酶活性的影響

Figure 4. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on the number of osteoclast bone absorption lacuna in osteoblast and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖4 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OC 骨吸收陷窩數(shù)目的影響

4 密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OC TRAP活性的影響

與對照組相比，MDP 含藥血清低劑量組OC 的TRAP 活性無顯著差異(P ＞0.05)。MDP 含藥血清中劑量組和高劑量組OC 的TRAP 活性在6 和7 d與同一時段對照組相比較明顯降低(P ＜0.01)，見圖5。

Figure 5. Effects of the serum containing MDP at different concentrations on TRAP activity of osteoclasts in osteoblasts and osteoclast co-culture system at different time points. ＊＊P ＜0.01 vs normal.圖5 不同濃度密骨打老兒丸含藥血清對共育體系中OCTRAP活性的影響

討 論

OB 不僅分泌骨基質(zhì)參與骨形成，也參與OC 骨吸收功能的調(diào)節(jié)［11］。正常骨重建起始于OC 激活，OC 性骨吸收伴隨生命活動的始末，如果OC 異?；钴S，可誘發(fā)骨質(zhì)疏松癥。ALP 是OB 分化時所分泌的酶，是OB 早期和中期分化的標(biāo)志物［12］，能夠反映OB 合成Ⅰ型膠原、形成骨基質(zhì)的能力。ALP 的活性體現(xiàn)OB 的成骨活性［13］。ALP 在體外鈣化中起著關(guān)鍵性作用，其機(jī)制在于ALP 能夠水解有機(jī)磷酸酶，使局部PO43-濃度升高，破壞鈣化抑制劑，而啟動鈣化［14］。本實驗顯示，中、高濃度的MDP 含藥血清組與對照組相比，ALP 合成增多，活性增強(qiáng)，證實MDP 含藥血清能促進(jìn)共育體系的OB 分化，刺激骨形成。

骨基質(zhì)的降解需要多種溶酶體參與，TRAP 是酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)的同工酶之一，直接參與OC 的骨吸收過程［15］。TRAP 標(biāo)志著OC 的活性，血清中TRAP 是反映OC 功能、判斷骨吸收的敏感特異性指標(biāo)［16］。本實驗顯示，在成骨-破骨共育體系中，隨著培養(yǎng)時間的延長，中、高濃度MDP 含藥血清組和對照組相比，TRAP 活性都有所降低，提示MDP 含藥血清有抑制共育體系中OC 分泌TRAP的能力。

OC 在骨重建過程中起著啟動和先鋒作用。OC有極強(qiáng)的溶骨能力，其功能過度活躍時，骨吸收亢進(jìn)，在骨表面和較深處形成較多的凹陷、腔隙(howship 陷窩)，甚至出現(xiàn)隧道，呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松。骨磨片上吸收陷窩是OC 骨吸收的直接結(jié)果，其陷窩數(shù)量、大小和深度直接反映了OC 的骨吸收能力。骨吸收陷窩光鏡計數(shù)法是評價體外培養(yǎng)OC 骨吸收功能的定量可靠方法。本實驗結(jié)果顯示，在成骨-破骨共育體系中，中、高濃度的MDP 含藥血清組骨吸收陷窩數(shù)目明顯低于對照組。說明中、高濃度的MDP 含藥血清能夠?qū)灿w系中OC 骨吸收功能有直接抑制作用，阻止骨丟失。

細(xì)胞信息交流(即細(xì)胞通訊，cell communication)存在長距通訊和短距通訊2 種方式，長距通訊以激素或生長因子為介質(zhì)，通過血液循環(huán)和局部組織液的流動，將信息從一個細(xì)胞傳到另一個細(xì)胞;短距通訊在相鄰的細(xì)胞間形成直接通道，信息物質(zhì)由此進(jìn)行交流。骨組織代謝是由OB 和OC 分別承擔(dān)的，處于骨形成和骨吸收不斷更新和轉(zhuǎn)換的動態(tài)平衡的骨重建活動中。OB 和OC 之間的功能活動并不是孤立存在的，二者之間的相互作用是骨代謝的直接調(diào)節(jié)因素。從單一OB 或OC 培養(yǎng)中獲得的實驗結(jié)果與在2 種細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)時不同［17］。建立培養(yǎng)上清可以相互交流，但OB 和OC 互不接觸的共育模型更能反映骨代謝的實際情況。

本研究共育體系呈左右兩室平行結(jié)構(gòu)，能在倒置顯微鏡下觀察2 種細(xì)胞的情況，可同時收集兩室的OB 和OC 進(jìn)行定量指標(biāo)的檢測;中間隔膜的孔徑與雙層式共育體系的孔徑一樣為0.45 μm，在此孔徑下，蛋白質(zhì)可以自由通過，而OB 和OC 因直徑在30 μm 以上，不能越過濾隔膜，OB 和OC 分泌的蛋白質(zhì)可以通過微孔濾膜影響對方的生物學(xué)功能。本實驗中，OC 可以促進(jìn)OB 增殖和分化，OB 也可以促進(jìn)OC 骨吸收作用，即OB 和OC 具有相互促進(jìn)功能，其途徑是OC 分泌了某些蛋白質(zhì)，彌散到隔膜的另一側(cè)影響了OB 功能。這些蛋白質(zhì)中是否含有某些新的信號分子，詳細(xì)機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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