肖 海， 賀興波， 黃才斌， 劉 瑤△

(贛南醫(yī)學(xué)院1病理學(xué)教研室，2第一附屬醫(yī)院醫(yī)務(wù)科，3第一附屬醫(yī)院消化科，江西 贛州341000)

原發(fā)性肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是一種全球高度惡性的腫瘤，大多數(shù)肝癌患者在發(fā)現(xiàn)癥狀時(shí)已處于病程的中晚期階段，錯(cuò)過(guò)了手術(shù)治療的最佳時(shí)機(jī)［1］。我們前期研究發(fā)現(xiàn):原發(fā)性肝細(xì)胞癌組織中檢測(cè)到泛素連接酶SIAH2(seven in absentia homolog 2)的高表達(dá)［2］。我們推測(cè)，SIAH2 可能是一個(gè)促進(jìn)肝癌發(fā)生發(fā)展的癌基因。本研究利用RNA干擾技術(shù)抑制肝癌細(xì)胞中SIAH2 的表達(dá)，觀察其對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，為以SIAH2 為靶標(biāo)的肝癌基因治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

人肝癌細(xì)胞株HepG2 由本室保存;pGenesil-SIAH2 重組質(zhì)粒由本室前期構(gòu)建;Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen;RPMI-1640 培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自Gibco;MTS 試劑盒購(gòu)自Promega;Annexin V-PE/ 7-氨基放線菌素D(7-aminoactinomycin D，7-AAD)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物發(fā)展技術(shù)有限公司;細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。RNA 提取液購(gòu)自武漢祥云博生物工程技術(shù)有限公司，cDNA 第1 鏈合成試劑盒、藍(lán)色預(yù)染PCR Mix以及DNA markerⅡ購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。兔抗人SIAH2 及GAPDH 單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz;山羊抗兔IgG-HRP 購(gòu)自武漢興華基因生物科技有限公司;ECL 為Pierce 產(chǎn)品。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 HepG2 細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基(含1 ×105U/L青霉素和100 mg/L 鏈霉素)中培養(yǎng)，于37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3d 傳代1 次。用去內(nèi)毒素質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒pGenesil-SIAH2 和pGenesil-1，其含量和純度測(cè)定按分子克隆所述。通過(guò)Lipofectamin 2000 轉(zhuǎn)染處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，每1 ×106個(gè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 μg 質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染pGenesil-SIAH2 細(xì)胞的HepG2 細(xì)胞命名為HepG2-SIAH2細(xì)胞;未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2 細(xì)胞為陰性對(duì)照;轉(zhuǎn)染空載體pGenesil-1 的HepG2 細(xì)胞命名為HepG2-neo 細(xì)胞;脂質(zhì)體對(duì)照組命名為HepG2-Lipo 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后24 h 在倒置熒光顯微鏡觀察瞬時(shí)轉(zhuǎn)染各組細(xì)胞的熒光強(qiáng)度。

2.2 RT-PCR 檢測(cè)SIAH2 mRNA 的表達(dá) 提取轉(zhuǎn)染后72 h HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞總RNA，按試劑盒要求逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。SIAH2(152 bp)上游引物5’-GAT CCA CAT GAA CGC ACG-3’，下游引物5’-GAG GGA AGC CAC GTG TAA AC-3’;內(nèi)參照GAPDH(258 bp)上游引物5’-AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG-3’，下游引物5’-AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC-3’。PCR反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃30 s，48 ℃30 s，72 ℃30 s，共35 個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后72 ℃10 min反應(yīng)結(jié)束，擴(kuò)增產(chǎn)物于1 % 瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2.3 Western blotting 檢測(cè)SIAH2 蛋白的表達(dá) 按試劑盒要求提取轉(zhuǎn)染后72 h HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞總蛋白并定量。取40 μg 總蛋白變性5 min，進(jìn)行12% SDS-PAGE 電泳，按照marker 切去需要的凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用含10% 脫脂奶粉的TBS 4 ℃封閉過(guò)夜，加入特異性SIAH2 和GAPDHⅠ抗(濃度均為1∶1 000)，37 ℃孵育1 h;室溫TBST 漂洗4 次，每次15 min。Ⅱ抗(1∶2 000)37 ℃孵育1 h，室溫漂洗4 次，每次15 min。反應(yīng)信號(hào)經(jīng)化學(xué)熒光底物發(fā)光，X 線膠片曝光。

2.4 MTS 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×108cells/L，取100 μL/well 接種至96 孔板。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染操作同前所述。HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞分別在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、48 h 和72 h 將對(duì)應(yīng)96 孔板換液并加入100 μL/well RPMI-1640 培養(yǎng)液及10 μL/well MTS。室溫、5% CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀讀取A490數(shù)據(jù)。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)= (1 - 實(shí)驗(yàn)孔A值/對(duì)照孔A 值)×100%。

2.5 細(xì)胞周期分析 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染后48 h 的HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L;制備的單細(xì)胞懸液用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇固定，4 ℃保存過(guò)夜，染色前用PBS 洗去固定液;加50 μL RNase A 37 ℃水浴30 min;再加200 μL PI 染色均勻，4 ℃避光30 min;上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm 處紅色熒光。

2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 分別用0.25%胰蛋白酶消化并收集轉(zhuǎn)染后48 h 的HepG2-SIAH2、HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109cells/L;加入200 μL Binding Buffer 懸浮細(xì)胞;加入5 μL Annexin V-PE 混勻后，加入5 μL 7-AAD混勻，室溫避光反應(yīng)5 ～15 min;在1 h 之內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間比較用單因素方差分析，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況

HepG2 細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染重組載體pGenesil-SIAH2和空載體pGenesil-1 24 h 后，均可見明顯的綠色熒光。脂質(zhì)體組和未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2 僅見到微弱的熒光，見圖1。

2 RT-PCR 檢測(cè)SIAH2 mRNA 表達(dá)水平

RT-PCR 結(jié)果顯示，HepG2-SIAH2 細(xì)胞SIAH2 mRNA 表達(dá)量(0.02 ±0.02)顯著低于正常HepG2 細(xì)胞(0.11 ±0.05)、HepG2-neo 細(xì)胞(0.13 ±0.04)和HepG2-Lipo 細(xì)胞(0. 12 ± 0. 01)(均P ＜0. 05)。HepG2-neo 細(xì)胞、HepG2-Lipo 細(xì)胞和正常HepG2 細(xì)胞之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖2。

Figure 1. Detection of transfection efficiency by fluorescence microscopy (×200).圖1 熒光顯微鏡下觀察各組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率

Figure 2. The expression of SIAH2 mRNA in each group after transfection. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs other groups.圖2 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SIAH2 mRNA 相對(duì)表達(dá)量

3 Western blotting 檢測(cè)SIAH2 蛋白表達(dá)水平

Weatern blotting 結(jié)果顯示，HepG2-SIAH2 細(xì)胞SIAH2 蛋白表達(dá)量(0.68 ± 0.01)顯著低于正常HepG2 細(xì)胞(1.09 ±0.02)、HepG2-neo 細(xì)胞(1.05 ±0.04)和HepG2-Lipo 細(xì)胞(1.04 ± 0.04)(均P ＜0.05)。HepG2-neo 細(xì)胞、HepG2-Lipo 細(xì)胞和正常HepG2 細(xì)胞之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖3。

Figure 3. The expression of SIAH2 protein in each group after transfection. Mean ± SD. n =3. * P ＜0.05 vs other groups.圖3 各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后SIAH2 蛋白相對(duì)表達(dá)量

4 pGenesil-SIAH2 抑制HepG2 細(xì)胞的增殖

用MTS 比色法檢測(cè)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后12 ～72 h的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖速度較其它各組明顯減慢，各時(shí)點(diǎn)吸光度值明顯低于HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞(P ＜0.05)。HepG2-neo、HepG2-Lipo 和正常HepG2 細(xì)胞之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)。轉(zhuǎn)染pGenesil-SIAH2 24 h 細(xì)胞吸光度值開始下降，細(xì)胞增殖抑制率為36.3% ±2.3%;48 h 抑制效果最明顯，抑制率為55.2% ±4.2%;48 h 后抑制效應(yīng)減弱，增殖速度有所提高，但仍低于其它各組;72 h 細(xì)胞抑制率為51.1% ±1.2%，各時(shí)點(diǎn)吸光度值見表1。

5 pGenesil-SIAH2 對(duì)HepG2 細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞周期的變化，與HepG2 細(xì)胞［G1期(44.62 ±0.23)%，S 期(25.66± 0.16)%］、HepG2-neo 細(xì) 胞［G1期(46.87 ±0.12)%，S 期(25.71 ±0.87)%］和HepG2-Lipo 細(xì)胞［G1期(45.29 ±0.35)%，S 期(25.92 ±0.66)%］相比較，HepG2-SIAH2 細(xì)胞G1期細(xì)胞顯著增多，S 期細(xì)胞顯著減少［G1期(49.68±0.25)%，S 期(22.94 ±0.66)%］，細(xì)胞明顯阻滯于G1期(P ＜0.05)，見圖4。

表1 MTS 法檢測(cè)pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染對(duì)HepG2 細(xì)胞增殖的影響Table 1. Effects of pGenesil-SIAH2 transfection on the proliferation of HepG2 cells measured by MTS assay(Mean±SD.n=3)

Figure 4. The cell cycle of HepG2 cells measured by flow cytometry. A:HepG2;B:HepG2-neo;C:HepG2-Lipo;D:HepG2-SIAH2.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs other groups.圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞細(xì)胞周期的變化

6 pGenesil-SIAH2 對(duì)HepG2 細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-PE/7-AAD 流式細(xì)胞術(shù)可將實(shí)驗(yàn)樣本中的正常、早期凋亡、晚期凋亡和壞死細(xì)胞區(qū)分開來(lái)，即左下象限(LL)為活細(xì)胞(Annexin V-/7-AAD-)，右下象限(LR)為早期凋亡細(xì)胞(Annexin V+/7-AAD-)，右上象限(UR)為晚期凋亡和壞死細(xì)胞(Annexin V+/7-AAD+)。流式結(jié)果顯示，與HepG2、HepG2-neo 和HepG2-Lipo 組相比，HepG2-SIAH2 組早期凋亡率明顯增高，差異顯著(P ＜0.05)。HepG2、HepG2-neo 和HepG2-Lipo 組之間，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，見圖5。

討 論

泛素化修飾是近幾年在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種與磷酸化作用相似的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，與細(xì)胞生命活動(dòng)、神經(jīng)系統(tǒng)退行性變、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)均有著密切的關(guān)系，特別在精細(xì)調(diào)控細(xì)胞周期，抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡以及激活轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)等方面發(fā)揮了重要作用，是蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的重要調(diào)節(jié)機(jī)制之一［3］。泛素化修飾主要發(fā)生在賴氨酸殘基的側(cè)鏈，其過(guò)程是在泛素激活酶E1 和泛素結(jié)合酶E2 協(xié)同下，泛素連接酶E3 募集特異的靶蛋白和E2，并介導(dǎo)泛素與靶蛋白共價(jià)結(jié)合，形成多聚泛素鏈，26S 蛋白酶體隨后識(shí)別并降解帶有多聚泛素鏈的靶蛋白［4］。E3 泛素連接酶也可以通過(guò)單泛素化方式修飾靶蛋白，調(diào)節(jié)靶蛋白功能。當(dāng)E3 發(fā)生功能性突變時(shí)，其對(duì)靶蛋白的調(diào)控能力喪失可引起癌蛋白聚集、抑癌蛋白異常降解、細(xì)胞凋亡受阻或/和增殖加速，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展［5-6］。

Figure 5. The apoptotic rate of HepG2 cells detected by flow cytometry. A:HepG2;B:HepG2-neo;C:HepG2-Lipo;D:HepG2-SIAH2.Mean±SD.n=3. * P ＜0.05 vs other groups.圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率的變化

SIAH 是在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的一種E3 泛素連接酶家族成員，其C 末端為底物結(jié)合域(substrate binding domain，SBD)，中間由2 個(gè)高度保守的的鋅指結(jié)構(gòu)域組成，N 末端含有40 ～80 個(gè)氨基酸殘基和典型的環(huán)指結(jié)構(gòu)域(ring finger domain)。人類SIAH2定位于染色體3q25，編碼324 個(gè)氨基酸［7］。研究發(fā)現(xiàn):胰腺癌和肺癌組織的中檢測(cè)到SIAH2 高表達(dá)，且SIAH2 的表達(dá)水平與腫瘤的臨床病理分期和分化程度相關(guān);SIAH2 在BxPC3、Panc-1 等胰腺癌細(xì)胞及BZR、A549 等肺癌細(xì)胞中有高表達(dá);抑制SIAH2 可顯著抑制人胰腺癌或肺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)［8-9］。功能結(jié)構(gòu)域缺陷的SIAH2 或SIAH2 的RNA干擾載體可降低磷酸化ERK 的活性，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［10］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn):SIAH2在肝癌組織中的表達(dá)陽(yáng)性率高于相應(yīng)癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SIAH2 表達(dá)水平與肝癌患者TNM分期具有相關(guān)性，與患者的性別、年齡、甲胎蛋白水平、腫瘤大小、血清HBsAg(hepatitis B surface antigen)水平和是否伴隨肝硬化不存在相關(guān)性［2］。上述研究結(jié)果提示，SIAH2 可能作為一個(gè)癌基因，在肝癌發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

本研究中，我們將前期篩選到的特異性靶向SIAH2 的RNA 干擾載體pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，RT-PCR 和Western blotting 結(jié)果證實(shí)SIAH2 mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著下調(diào)。MTS 結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGenesil-SIAH2 的HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。采用流式細(xì)胞術(shù)分析RNA 干擾對(duì)HepG2 細(xì)胞的增殖和細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示pGenesil-SIAH2 轉(zhuǎn)染48 h 后，G1期細(xì)胞比例明顯高于其它組，提示沉默SIAH2 基因可阻止G1期細(xì)胞進(jìn)入S 期，造成G1期細(xì)胞聚集，S 期細(xì)胞減少，從而抑制HepG2 細(xì)胞增殖［11］。

在凋亡的早期階段，分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)，從而被PS 特異的Annexin V 探針?biāo)鶚?biāo)記。將Annexin V 進(jìn)行熒光素PE 標(biāo)記，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［12］。核酸染料7-AAD 對(duì)細(xì)胞膜完整的活細(xì)胞和早期凋亡細(xì)胞是拒染的，而對(duì)膜完整性被破壞的晚期凋亡細(xì)胞或壞死細(xì)胞可以染色。因此，Annexin V-PE 結(jié)合7-AAD 雙染后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)3 個(gè)細(xì)胞群，即左下象限(LL)正常細(xì)胞、右下象限(LR)早期凋亡細(xì)胞和右上象限(UR)晚期凋亡和壞死細(xì)胞。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HepG2-SIAH2 細(xì)胞早期凋亡率較其它各組明顯升高。雖然凋亡早期細(xì)胞膜的完整性未遭到破壞，但胞內(nèi)早已啟動(dòng)了凋亡機(jī)制，比如線粒體膜電位的喪失、細(xì)胞色素C 進(jìn)入胞漿、細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高以及啟動(dòng)蛋白水解酶層疊級(jí)聯(lián)反應(yīng)等。凋亡晚期階段，細(xì)胞在蛋白水解酶等凋亡效應(yīng)分子的作用下，胞膜完整性遭到破壞，細(xì)胞皺縮，染色質(zhì)濃縮，DNA 裂解為長(zhǎng)度不等的片段(180 ～200 bp 整倍數(shù))，最后形成由細(xì)胞膜包裹的凋亡小體并被其它細(xì)胞所吞噬。細(xì)胞處于壞死階段時(shí)，細(xì)胞腫脹直至破裂并釋放出內(nèi)含物，常引起炎癥反應(yīng)。因此，相對(duì)于晚期凋亡和壞死而言，早期凋亡能更靈敏地體現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)因素作用下，細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生的一系列分子生物學(xué)事件。

綜上所述，利用RNA 干擾技術(shù)下調(diào)SIAH2 基因表達(dá)后，HepG2 細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢，增殖受抑且凋亡率增加。接下來(lái)我們將建立人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型，探討SIAH2 作為肝癌基因治療靶點(diǎn)的可行性，為進(jìn)一步闡明SIAH2 的分子生物學(xué)功能及其與肝癌發(fā)病的相關(guān)性，研制高效、特異的新型抗腫瘤藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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