劉純娥，李炳輝，鄒新華，馮自波，李春亭，潘青云，陳洪平，劉 浩

慢性皮膚潰瘍又稱難治性潰瘍，創(chuàng)面多經(jīng)久不愈。用蜂蠟麻油作為基質(zhì)或載體，加中藥制成的軟膏治療皮膚潰瘍創(chuàng)面，臨床應(yīng)用療效顯著。蜂蠟麻油混合物是否具有促進(jìn)皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合的作用，我們進(jìn)行了大鼠皮膚潰瘍的實(shí)驗(yàn)性研究，為功能性敷料提供循證醫(yī)學(xué)的依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD大鼠20只,體質(zhì)量（250±20）g，雌雄各半,購(gòu)自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物許可號(hào)SCXK鄂2008-0004）。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 蜂蠟麻油敷料由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院創(chuàng)面修復(fù)科提供，由適量的蜂蠟、天然植物提取物麻油等經(jīng)過(guò)一定工藝配置，涂布無(wú)菌紗布，經(jīng)環(huán)氧乙烷滅菌而成。麻油是純度為100%的藥用麻油，蜂蠟是熔點(diǎn)為66 ℃的藥用蜂蠟。均購(gòu)自武漢創(chuàng)新工業(yè)有限公司。

1.3 試劑 表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF)抗體及SP 免疫組化試劑盒均購(gòu)自北京中彬金橋生物技術(shù)開發(fā)有限公司。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）采用夾心法酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒購(gòu)自武漢博士得公司，產(chǎn)品編號(hào)DY3214。預(yù)先包被的抗體為單克隆抗體，克隆號(hào)26503.11。氫化可的松注射液購(gòu)自天津金耀氨基酸有限公司,生產(chǎn)批號(hào)0701042。

1.4 主要儀器 醫(yī)用微波爐、抗原修復(fù)盒及濕盒、酶標(biāo)儀型。

2 方法

2.1 造模 SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。備皮，于大鼠背部脊柱兩側(cè)手術(shù)刀切除皮膚及皮下組織，深達(dá)深筋膜，制造3個(gè)面積為1.8 cm×1.8 cm的創(chuàng)面。經(jīng)股部肌注氫化可的松4 mL/kg，連續(xù)3 d，延緩創(chuàng)面愈合。2.2 治療方法 左上側(cè)創(chuàng)面設(shè)為生理鹽水敷料組，右上側(cè)為凡士林敷料組，左下側(cè)為蜂蠟麻油敷料組。常規(guī)消毒，無(wú)菌敷料包扎，繃帶固定，每隔2 d換藥1 次。換藥前攝像，以測(cè)定皮膚潰瘍面積。每隔1周在無(wú)菌條件下，取標(biāo)本1次，生理鹽水清洗，無(wú)菌紗布沾干。一部分經(jīng)4%的中性甲醛固定用作免疫組織化學(xué)研究。另一部分放入-80 ℃液氮冰箱，作酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)研究。大鼠常規(guī)飼養(yǎng),自由飲水、進(jìn)食，治療時(shí)間為30 d。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 4%的中性甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4 μm)。行免疫組化SP 法，經(jīng)脫蠟、修復(fù)、標(biāo)記抗體、DAB 顯色、蘇木精淺淡復(fù)染等。實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵說(shuō)明書進(jìn)行，陽(yáng)性著色為棕黃色顆粒。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)EGF 含量 組織勻漿后，離心去除沉淀，取上清行酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法來(lái)測(cè)定標(biāo)本中蛋白質(zhì)的含量，在調(diào)至相同蛋白質(zhì)的含量后測(cè)定EGF含量。實(shí)驗(yàn)過(guò)程參照說(shuō)明書進(jìn)行。

2.5 創(chuàng)面愈合率計(jì)算 創(chuàng)面面積測(cè)量使用加拿大VEV公司創(chuàng)面面積測(cè)量軟件，創(chuàng)面愈合率=（治療前面積-治療后測(cè)量面積）/治療前面積×100%。

2.6 統(tǒng)計(jì)方法 用SPSS18.0 軟件作統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 創(chuàng)面愈合率 第7 d創(chuàng)面愈合率由低到高依次為生理鹽水組、凡士林組、蜂蠟麻油組（P ＞0.05)。第14 d創(chuàng)面愈合率由高到低為蜂蠟麻油組、凡士林組、生理鹽水組，且蜂蠟麻油組與凡士林組、生理鹽水組比較均有顯著差異（P＜0.01）。第21 d時(shí)創(chuàng)面愈合率順序同第14 d，蜂蠟麻油組與生理鹽水組比較有顯著差異（P ＜0.01），與凡士林組比較有顯著差異（P ＜0.05）。實(shí)驗(yàn)全程，生理鹽水組與凡士林組均無(wú)顯著差異（P＞0.05)。見表1。

表1 不同階段3組大鼠皮膚創(chuàng)面面積及愈合率比較(x±s，n=20)

3.2 創(chuàng)面EGF 含量 第7、14、21 d 創(chuàng)面EGF 含量，蜂蠟麻油組＞凡士林組＞生理鹽水組，且蜂蠟麻油組與凡士林組、生理鹽水組比較均有顯著差異(P ＜0.01)，而凡士林組與生理鹽水組比較無(wú)顯著差異。見表2。

3.3 EGF的表達(dá) EGF在細(xì)胞的胞漿中均有表達(dá)，第0、7 d免疫組化SP法染色無(wú)差異。第14、21 d，生理鹽水敷料組和凡士林敷料組呈淺棕黃色，蜂蠟麻油敷料組呈棕黃色反應(yīng)，見圖1。

免疫組化定量分析 根據(jù)組間來(lái)看，于7、14、21 d EGF 濃度的比較，差異顯著（P ＜0.001），且蜂蠟麻油組與凡士林組(P ＜0.001)、生理鹽水組比較均有顯著差異(P ＜0.001)，而凡士林組與生理鹽水組比較無(wú)顯著差異(P=0.1878)，見表3。

4 討論

慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面難以愈合，局部治療是手段之一。一些保護(hù)劑、抗生素、維生素、微量元素制劑雖被廣泛應(yīng)用，但基本停留在等待創(chuàng)面自然愈合階段，促進(jìn)創(chuàng)面愈合作用十分有限。目前國(guó)內(nèi)用于治療慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面的以中藥制劑膏劑為主，功能性敷料甚少。國(guó)外敷料臨床作用并不顯著，且價(jià)格昂貴。中醫(yī)外治體表潰瘍歷史悠久，經(jīng)驗(yàn)豐富，對(duì)促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)有著獨(dú)特的理解和豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)。開發(fā)利用祖國(guó)醫(yī)學(xué)的蜂蠟麻油混合物作為功能性敷料，療效好、價(jià)格低，符合中國(guó)國(guó)情。

表2 不同時(shí)間3組大鼠創(chuàng)面EGF濃度（pg/mL）比較(±s，n=20)

表2 不同時(shí)間3組大鼠創(chuàng)面EGF濃度（pg/mL）比較(±s，n=20)

注：與生理鹽水組比較，aP＜0.01；與凡士林組比較，bP＜0.01

0 d 7 d 14 d 21 d生理鹽水組38.875±2.245 11.250±3.379 14.625±2.490 19.375±3.023凡士林組39.125±3.059 22.375±5.651 20.875±4.963 22.625±5.467蜂蠟麻油組35.750±2.011 51.625±8.472a、b 42.250±7.554a、b 52.875±8.672a、b

圖1 不同時(shí)間大鼠創(chuàng)面EGF免疫組化染色(X40)

表3 不同時(shí)間3組大鼠創(chuàng)面免疫組化定量EGF濃度（pg/mL）比較(x±s，n=20)

表皮生長(zhǎng)因子是美國(guó)的Cohen于1962年在小鼠的頜下腺中發(fā)現(xiàn)的一種活性成分。大量的國(guó)內(nèi)外研究已證實(shí)，EGF 具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。如Sanz Garcia S 等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明[1]EGF 通過(guò)與細(xì)胞膜上的EGFR 相結(jié)合，形成受體-EGF 復(fù)合物，經(jīng)過(guò)自磷酸化等一系列生化反應(yīng)，誘導(dǎo)和直接調(diào)控細(xì)胞增值，啟動(dòng)創(chuàng)面修復(fù)的過(guò)程。有人發(fā)現(xiàn)，在需要修復(fù)的局部組織內(nèi)，EGF會(huì)明顯積聚，有利于創(chuàng)面的早期快速修復(fù)。表皮生長(zhǎng)因子表達(dá)量與創(chuàng)面愈合呈正相關(guān)。

1962 年Winter 發(fā)現(xiàn)，濕性環(huán)境有利于創(chuàng)面成纖維細(xì)胞增殖、表皮細(xì)胞遷移爬行、血管生成、生長(zhǎng)因子發(fā)揮作用和基質(zhì)合成沉積。麻油性甘、涼，具有生肌肉、止疼痛、消癰腫、下熱毒、補(bǔ)皮裂之功效，現(xiàn)代藥理研究，麻油能提供組織生長(zhǎng)需要的營(yíng)養(yǎng)成分，改善慢性潰瘍創(chuàng)面負(fù)氮平衡[2]，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。麻油紗布貼敷創(chuàng)面后再包扎，能夠有效的防止創(chuàng)面水分的蒸發(fā)，使創(chuàng)面保持一定的濕度，處于近似生理環(huán)境的條件下，通過(guò)無(wú)損傷的液化排除壞死組織，有利于創(chuàng)面上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)。同時(shí)，麻油可以減少創(chuàng)面的滲出，預(yù)防感染，減少紗布與皮膚創(chuàng)面粘連，有利于創(chuàng)面的愈合。蜂蠟，味甘，性微溫，具有收澀，斂瘡，生肌，止痛等功效，外用于潰瘍不斂，臁瘡糜爛，創(chuàng)傷，燒、燙傷等。付輝等通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)[3]，用蜂蠟制成的軟膏能明顯提高慢性皮膚潰瘍創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)，改善創(chuàng)面微循環(huán)，加速創(chuàng)面愈合過(guò)程。王會(huì)芹等運(yùn)用蜂蠟膏（蜂蠟和麻油組成）治療燙傷，效果顯著[4]；萬(wàn)明才等用于促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生肌液中，含有蜂蠟和大劑量的麻油[5]。

本研究中，第7 d、14 d、21 d時(shí)，3組EGF含量比較，蜂蠟麻油敷料組高于凡士林和生理鹽水敷料組，而創(chuàng)面愈合率則是蜂蠟麻油敷料組大于凡士林和生理鹽水敷料組。創(chuàng)面愈合率與其成正相關(guān)。ELISA測(cè)定EGF 含量，第7、14、21 d 麻油蜂蠟組創(chuàng)面EGF含量較凡士林組、生理鹽水組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；免疫組化發(fā)現(xiàn)麻油蜂蠟組創(chuàng)面細(xì)胞中EGF表達(dá)增加，定量分析有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。生理鹽水敷料組與凡士林敷料組EGF含量和創(chuàng)面愈合率比較，均無(wú)顯著差異。說(shuō)明麻油蜂蠟可能通過(guò)促進(jìn)創(chuàng)面新生肉芽組織表達(dá)EGF來(lái)促進(jìn)傷口愈合，但其具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

我們認(rèn)為，蜂蠟麻油膏促進(jìn)皮膚潰瘍創(chuàng)面愈合和增加創(chuàng)面組織EGF表達(dá)量的作用，蜂蠟麻油混合物作為一種功能敷料材料，可以臨床推廣。其機(jī)理可能在于：（1）蜂蠟麻油膏能改善慢性潰瘍創(chuàng)面負(fù)氮平衡，促進(jìn)創(chuàng)面愈合。（2）蜂蠟麻油膏提高慢性皮膚創(chuàng)面新生毛細(xì)血管數(shù)，改善創(chuàng)面微循環(huán)，加速創(chuàng)面愈合過(guò)程。

[1] Garcia SS, Heredero XS, Hernandez AI, et al. Experimental model for local application of growth factors in skin re-epithelialisation[J]. Scand J Plast Recons, 2000,34(3):199-206.

[2] 李俊,王秀成.褥瘡的臨床治療[J]. 中國(guó)燒傷瘡瘍雜志,2008,20（2）:135.

[3] 付輝,王新建.蜂蠟膏促進(jìn)糖尿病新西蘭兔創(chuàng)面愈合的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2007,(84)：340-343.

[4] 王會(huì)芹,劉文.蜂蠟治療燙傷[J]. 中國(guó)社區(qū)醫(yī)師,2008,10（190）:118.

[5] 萬(wàn)明才,馮峰,王新衛(wèi),等.生肌液復(fù)合封閉負(fù)壓引流技術(shù)對(duì)創(chuàng)面愈合的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)(中醫(yī)臨床版),2008,15(2):10-12.