裴國鳳，王海波，向榮華，梁曉聲

(中南民族大學 生命科學學院，武漢430074)

作為一種新型的熒光材料，量子點具有激發(fā)光譜寬，分布連續(xù)，發(fā)射光譜呈對稱性且半峰寬較窄，顏色可調(diào)的優(yōu)勢，與傳統(tǒng)的有機染料相比其熒光壽命長、QDs穩(wěn)定性好、熒光雜質(zhì)少、不易漂白、與生物體鏈接后不影響其活性、特異性高，在生命科學中具有廣闊的應用前景[1-3].量子點與熒光小分子相比亮度和穩(wěn)定性均較大提高，但量子點在加熱、高離子強度、氧化還原環(huán)境、金屬離子等情況下均發(fā)生焠滅，嚴重地制約了量子點的應用.目前量子點熒光影像監(jiān)測對病毒侵染等短時段行為的研究揭示了很多相關(guān)生物學問題.但對于較難生長的微生物，腸道菌群微生態(tài)的建立和變化，高等動植物的發(fā)育等過程，量子點還無法做到實時全程監(jiān)測.

研究發(fā)現(xiàn)在合成完成量子點后再換用更穩(wěn)溫和無毒的元素(硫、鋅等)進行加殼可大大提高量子點的量子效率、穩(wěn)定性和生物相容性. Alivisatos等[4]利用硅酸酯水解技術(shù)首創(chuàng)了量子點的氧化硅結(jié)果包殼，使得量子點易于與蛋白和核酸等交聯(lián).水熱合成量子點熒光效率高、合成簡單、無需水/油相轉(zhuǎn)化，降低了量子點合成成本.利用硅酸酯的Stober水解法用于合成抗熱量子點或改善其熒光效率[5].基于Stober硅烷水解技術(shù)，本文設計了氨基硅烷試劑和硅酸酯2步水解，對量子點進行2步加殼，合成了熱、化學、生物穩(wěn)定性較好，適合超長時間影像的雙層加殼量子點，最長可達7 d的熒光監(jiān)測.

1 實驗部分

1.1 樣品、試劑和儀器

氨水(武漢洪山中南化工試劑有限公司)，3-氨基丙基三乙氧基硅烷(純度98.0％，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司)，正硅酸乙酯(TEOS，純度98.0％，F(xiàn)luka公司)，還原型谷胱甘肽(Sigma公司)，酵母浸粉和蛋白胨(Oxiod公司).葡萄糖、蘋果酸、KH2PO4、NaBH4、CdCl2·2.5H2O、Na2TeO3、EDTA-Na2、CdCl2·6H2O、NaCl、I2、MgSO4·7H2O 、(NH4)2SO4、FeSO4·7H2O、FeCl3·6H2O、CoCl2·6H2O(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)，水為millpore超純水.

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限公司)，F(xiàn)A1004電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，電子萬用爐(北京永光明醫(yī)療儀器廠)，QYD-200全溫培養(yǎng)搖床(上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司)，WD-9403E型手提紫外燈(北京六一儀器廠)，GeneGenius凝膠成像系統(tǒng)(Synoptics公司)，熒光光度計(F-2500，日本日立)，透射電子顯微鏡(H7650，日本日立).

1.2 CdTe量子點的合成及加殼

1.2.1 CdTe量子點的合成

量子點參照文獻[6]合成，具體步驟為：依次將0.04 M CdCl216 mL，檸檬酸鈉400 mg，蘋果酸400mg，0.01 M Na2TeO316 mL，NaBH4200 mg加入三口圓底燒瓶中，補水至200 mL.在強磁力攪拌下加熱至沸進行反應，約95 min后在紫外激發(fā)下有近550 nm綠色熒光時停止反應，得到發(fā)射峰約為550 nm的CdTe量子點膠體溶液.加入適量丙酮，離心棄上清，沉淀水重懸，稀釋后用紫外分光光度計測定并計算濃度[7,8].

1.2.2 CdTe量子點的加殼

取5支10 mL的離心管加入6 mL純化后的量子點(10 μM)加300 μL 6.25％氨水混勻，其中再分別加12 μL 的r(H2O︰C9H23NO3Si)=30︰1,60︰1,120︰1,240︰1 (C9H23NO3Si為3-氨基丙基三乙氧基硅烷)的混合試劑；置于搖床中避光振蕩1 h，使C9H23NO3Si能均勻地包覆在CdTe量子點的外面，再加入1188 μL 的r(H2O︰TEOS)=120︰1的混合試劑置于避光搖床中，振蕩過夜.丙酮沉淀棄上清，純水重懸.

1.3 利用量子點熱抗性對加殼條件優(yōu)化

取等濃度不同C9H23NO3Si加殼條件量子點各1 mL加入去離子水3 mL，在沸水浴中加熱，每隔15 min取樣60 μL，加熱90 min，共取樣7次， 用熒光分光光度計測其熒光發(fā)射峰面積，得出各種加殼條件量子點熒光強度隨加熱時間的變化對比圖.

1.4 量子點的表征

1.4.1 量子點的熒光表征

取用優(yōu)化條件加殼得到的量子點及為加殼的量子點對照，適當稀釋與熒光分光光度計在380 nm激發(fā)光下測定其450～650 nm發(fā)射峰，測定數(shù)值以峰值為1進行歸一化處理.

1.4.2 量子點的透射電子顯微鏡表征

滴一滴量子點溶液至封口膜上，把銅網(wǎng)的碳支持膜面蓋在液滴上固定數(shù)分鐘后，銅網(wǎng)蓋在醋酸雙氧鈾液滴1～2 min，上自然干燥后制得TEM 樣品.TEM 樣品用透射電鏡進行觀察.

1.5 加殼量子點多種化學因素抗性評估

對半稀釋法配制EDTA 5,2.5,1.25,0.625,0.3125 mM.取一塊多孔板，向前三排中每孔加入100 μL 10 μM的CdTe量子點，后三排孔中每孔加入100μL 10 μM 的r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1加殼CdTe量子點.向上述對應的量子點中每列依次加入配置好的EDTA溶液10 μL，根據(jù)量子點的淬滅情況(未加殼的量子點淬滅，加殼的量子點未淬滅)，獲得最有差異效果的EDTA濃度.類似依次做CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、巰基還原劑、CoCl2的濃度梯度，獲得最有差異效果的濃度.

同上分別配置最有差異效果濃度的EDTA、CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、CoCl2和還原型谷胱甘肽溶液，檢測金屬離子對加殼量子點和未加殼量子點穩(wěn)定性的影響.分別加入100 μL 10 μM的CdTe量子點和同樣濃度的加殼量子點，10 μL上述絡合劑、金屬離子和氧化還原試劑，混合均勻，5 min后熒光分光光度計測定剩余熒光強度.

1.6 加殼量子點用于微生物超長時間影像

LB培養(yǎng)基分別培養(yǎng)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌K12株至對數(shù)期，8000 g×5 min離心，棄上清，沉淀用合成培養(yǎng)基(配方為：2％葡萄糖，0.5％硫酸銨，0.05％磷酸氫二鉀，0.001％七水硫酸亞鐵，0.02％七水硫酸鎂)洗滌1次，再離心，棄上清，沉淀用合成培養(yǎng)基稀釋至OD為1.培養(yǎng)液中加入1/10 (V/V) 10 μM的加殼量子點，37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)，以2 h為間隔取樣至熒光分光光度計測定至無熒光.

2 結(jié)果與討論

2.1 利用量子點熱抗性對加殼條件的優(yōu)化

量子點通過二次加殼，可獲得除熱穩(wěn)定性以外的對離子、螯合劑、氧化還原劑等不同程度的抗性.其抗性的獲得取決于第一步氨基硅烷化試劑在量子點顆粒表面水解聚合形成有自由氨基的保護殼，加殼程度與其穩(wěn)定性密切相關(guān).本文以熱穩(wěn)定性為考核指標，優(yōu)化了第一步氨基硅烷化試劑加殼劑量，結(jié)果見圖1.如圖1所示，與未加殼量子點相比，加殼量子點在熱穩(wěn)定性、加熱后量子效率方面均有了顯著的提高.以r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1條件加殼的CdTe量子點提高熒光強度最為顯著.因納米材料為亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)，熱能加快表面離子和分子的熱運動，導致表面的鎘和碲等元素從納米顆粒上脫落下來，造成量子點熒光的減弱甚至焠滅.通過加殼限制表面離子的運動，提高了穩(wěn)定性.本文在加殼材料中引入了氨基，氨基可與鎘離子發(fā)生絡合，在量子點周圍形成高鎘離子濃度的區(qū)域，使得表面離子更易達到吸附平衡不易脫落. 以r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1加殼的CdTe量子點熱抗性最高，說明引入的氨基有效性最高，故后續(xù)表征和實驗均以該條件加殼的量子點來進行.

1)未加殼量子點；2～4) 分別為r(H2O︰C9H23NO3Si)=60︰1,120︰1,240︰1的加殼CdTe量子點

2.2 加殼量子點的表征

加殼量子點的TEM圖結(jié)果見圖2.由圖2可見，量子點未加殼為點狀，直徑在5 nm以下，與文獻報道符合，經(jīng)加殼后不同納米顆粒間的機硅酸酯水解相連形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu).未見明顯的沉淀，故可以用于組織靶向、動物活體成像等方面.

a) 發(fā)射峰約550 nm未加殼量子點的TEM圖； b) 發(fā)射峰約550 nm加殼量子點的TEM圖

通過熒光分光光度計表征發(fā)量子點包殼前后發(fā)射光譜，結(jié)果如圖3.圖3顯示未加殼量子點發(fā)射峰峰型較好，半峰寬較窄約50 nm，加殼后半峰寬變?yōu)?00 nm左右.另外，加殼后最大發(fā)射峰發(fā)生輕微藍移，說明在包殼過程中隨著硅殼包覆，表面結(jié)合不夠緊密的鎘碲等離子丟失.因量子點發(fā)射光譜與直徑相關(guān)，直徑越小發(fā)射波長越短，加殼后半峰寬變寬表明量子點單分散性變差，顆粒大小不均一程度變大.

λ/nm

2.3 加殼量子點多種化學因素抗性

分別對加殼量子點進行了EDTA、CdCl2、NaCl、I2、FeSO4、FeCl3、CoCl2和還原型谷胱甘肽等化學穩(wěn)定性實驗結(jié)果見圖4.由圖4可見，圖中顯示除EDTA、CdCl2、CoCl2外，加殼量子點均較未加殼量子點抗性增強，尤其對高達0.5 M的氯化鈉和遠高于細胞內(nèi)濃度的谷胱甘肽，說明該材料可適應大多數(shù)生化體內(nèi)體外反映的條件.EDTA加殼未顯示出良好的抗性則與其絡合穩(wěn)定常數(shù)太大有關(guān).鎘離子及鈷離子顯示了相反的趨勢是由于前兩者結(jié)合到量子點表面使量子點有效粒徑變大，其發(fā)射峰往長波長紅移.黃色量子效率最高[9]，本文所有量子點為黃綠色，紅移往黃色移，故量子效率除了受金屬離子負影響外還會有一定的增加，而包殼后的量子點鎘離子被氨基屏蔽則沒有這種增益效果.

1)加殼量子點；2) 未加殼量子點

2.4 加殼量子點用于微生物超長時間影像

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為例估加殼對其生物穩(wěn)定性的影響.圖5中顯示，與金黃色葡萄球菌共同培養(yǎng)12 h，未加殼量子點熒光完全焠滅，而加殼量子點熒光還有80％以上剩余，直至168h以后才完全焠滅.可用于長達7 d的活體成像或腸道微生態(tài)影像，甚或一些難生長的微生物.與革蘭氏陰性菌大腸桿菌K12株培養(yǎng)8 h，包殼量子點熒光完全焠滅，而加殼量子點至48h熒光才完全焠滅，因不同菌株產(chǎn)酸等能力有差異.

3 結(jié)論

(1)采用Stober法進行了量子點加殼，首創(chuàng)了3-氨基丙基三乙氧基硅烷和正硅酸乙酯2步水解加殼法，優(yōu)化了加殼條件合成雙層加殼量子點.

(2)評估了該量子點的化學穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)其對金屬離子，氧化還原試劑均有很好抗性.

(3)以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為例，對加殼量子點超長時間生物影像能力進行了評估.發(fā)現(xiàn)其熒光可最多延續(xù)1周才完全焠滅，較未加殼量子點提高了10多倍.

a) 共培養(yǎng)微生物為金黃色葡萄球菌 b) 共培養(yǎng)微生物為大腸桿菌K12株

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