覃 瑞，賴娟娟，李作洲，滿玉萍，王彥昌,*

(1中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074；2中國科學院 武漢植物園， 植物種質(zhì)創(chuàng)新與特色農(nóng)業(yè)重點實驗室，武漢430074)

軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)為獼猴桃屬多年生木質(zhì)藤本植物[1]，是該屬下進化地位較為原始的一個物種.其果實小，果面光滑無毛，富含多種人體必要的氨基酸、礦物質(zhì)和維生素，除可用于鮮食外，還是果汁、罐頭、果脯及釀酒的優(yōu)質(zhì)原料[1,2].我國和其他東北亞地區(qū)是軟棗獼猴桃野生資源的主要分布區(qū)[3]，該種是獼猴桃屬下分布范圍最廣的物種，野外變異極為豐富.研究野生軟棗獼猴桃的遺傳多樣性對了解不同地區(qū)軟棗獼猴桃起源、進化、種植收集利用與保存均具有重要意義.

目前對該物種的遺傳多樣性了解有限，尤其對各分布區(qū)野生居群的遺傳評價較少.路文鵬[4]、黃岳等[5]利用RAPD技術(shù)對長白山小范圍分布的少量樣本進行了初步研究，但涉及取樣范圍小，不能代表一個地區(qū)整體或不同區(qū)域間的資源遺傳分化.而近年DNA標記技術(shù)的迅速發(fā)展為獼猴桃屬植物的系統(tǒng)關(guān)系等研究提供了手段，其中SSR(簡單重復序列)標記在植物的品種和親緣關(guān)系鑒定等方面得到了廣泛的應(yīng)用.SSR比其他分子標記具有位點豐富、共顯性、簡便易操作、重復性和穩(wěn)定性好等顯著優(yōu)勢[6].在主要栽培種中華獼猴桃中，已開發(fā)了大量SSR引物，但適用于野生軟棗獼猴桃居群遺傳多樣性評價的SSR引物還較缺乏，在我們前期篩選的軟棗獼猴桃引物基礎(chǔ)上[7]，本研究進一步優(yōu)化擴增條件，篩選出了多態(tài)性較好適合軟棗野生居群分析的SSR引物，為該物種大格局遺傳多樣性研究提供了有效的分子工具.

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

從來自陜西眉縣、戶縣、吉林露水河、天全縣二郎山、陜西安康等5個軟棗獼猴桃(Actinidiaarguta)野生居群中隨機選擇8份樣本作為擴增篩選的樣品.引物篩選完成后，從天全縣二郎山選取15個樣品對篩選出的引物進行驗證分析，樣本分布的地理位置：經(jīng)度在29°54′54.65″～29°57′30.44″，緯度在 102°22′51.34″～102°24′32.61″，海拔高度在1316.7～1463.9m之間.

PCR擴增儀[TC-96/G/H(b)A，杭州博日科技有限公司]，電泳儀(DYCZ-20E型,DYY-12型,北京六一儀器廠)，離心機(eppendorf centrifuge5810)，恒溫水浴鍋(普瑞斯機械有限公司)，成像凝膠系統(tǒng)(Tanon 2500R)，高壓滅菌鍋(HIRAYAMA)，電子天平(上海浦春計量儀器有限公司).

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取0.2 g軟棗獼猴桃葉片放入事先預冷的研缽中，加入液氮快速研磨后用經(jīng)典CTAB法[8]加以改進提取DNA.加入100 μL TE緩沖液于4℃下溶解DNA -20℃?zhèn)溆?

1.2.2 引物選擇

從來自于中華獼猴桃二倍體基因組SSR中選擇65對SSR引物[9]用于野生軟棗獼猴桃的SSR篩選.

1.2.3 PCR反應(yīng)

PCR反應(yīng)采用10 μL反應(yīng)體系，50～100 ng模板DNA 2 μL，10×buffer緩沖液1μL， MgCl20.6 μL，4×dNTPs 0.2 μL，SSR引物上游引物和下游引物各0.1 μL， Taq DNA 聚合酶0.1μL.用降落PCR進行擴增，反應(yīng)程序為：①95℃預變性5 min；②94℃變性50 s；③61℃退火50 s；④72℃延伸1 min；②～④5個循環(huán)，每個循環(huán)中退火溫度降1℃；⑤94℃變性50 s；⑥56℃退火50 s；⑦72℃延伸1min；⑤～⑦35個循環(huán)；⑧72℃保溫8min；⑨4℃保存樣品.

1.2.4 電泳檢測

通過瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察，將沒有擴增出來或者擴增率低于60％的引物剔除，將擴增率高于60％的引物在6％聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳分離1.5 h(恒定功率55W)，銀染檢測.

1.2.5 群體驗證

從天全二郎山選取15個樣品對即將篩選出的引物進行驗證分析，將每對引物分別對應(yīng)該15個樣品進行SSR-PCR擴增，在6％聚丙烯酰胺非變性凝膠上電泳分離1.5h(恒定功率55W)，讀取帶型.

1.2.6 SSR數(shù)據(jù)分析

所有材料各SSR位點的不同等位變異在聚丙烯酰胺凝膠上均表現(xiàn)為譜帶的有或無，將“有”賦值為“1”，將“無”賦值為“0”，構(gòu)建15對SSR引物擴增結(jié)果的數(shù)據(jù)庫，參考Korkovelos等的數(shù)據(jù)分析方法[10].通過treev32軟件進行個體聚類NJ數(shù)的構(gòu)建.

2 結(jié)果與分析

2.1 獼猴桃DNA質(zhì)量檢驗

對所有樣品進行瓊脂糖檢測，結(jié)果見圖1.圖1中顯示為一條完整的清晰帶，沒有明顯的拖尾，也未見RNA條帶，說明DNA提取質(zhì)量高．完整性好[11]，可用于SSR引物的篩選分析和其他相關(guān)試驗.

M) DNA Marker；1～18) 依次為：MQL-1,MQL-15,HQL-12,LSH-4,DBS-1,TYA-1,TYA-3 T,TYA-5、8～11、13、15～19

2.2 引物的初步篩選

將65對選定的引物對來自不同群體的8個DNA樣品進行PCR擴增，擴增結(jié)果通過1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測，剔除未擴增出條帶的引物，結(jié)果見圖2、圖3.如圖2所示，引物UDK-125對應(yīng)的8個樣品均能擴增出來，引物UDK-131和引物UDK-158中有1～2個樣品未擴增出產(chǎn)物，選擇的引物進入第二輪篩選；如圖3所示，引物UDK-127，UDK-132，UDK-154對應(yīng)的8個樣品只有0～3個能擴增出來，故剔除.最終選出32對擴增產(chǎn)物較好的引物.

M) DNA Marker; 1～8)依次為：MQI-1、16，HQL-12、25，TYA-1、18，LSH-13，DBS-20;A～C依次為：UDK-125，131，158

M) DNA Marker; 1～8)依次為：MQI-1、16，HQL-12、25，TYA-1、18，LSH-13，DBS-20;A～C依次為：UDK-127，132，157

將選出的32對引物進行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(見圖4)，8個樣品中擴增率大于等于38％的引物可用，擴增率低于38％的引物剔除.引物UDK-125、UDK-128、UDK-131擴增率均大于80％，而引物UDK-126擴增率則低于38％，故剔除.結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中15對引物有擴增，3對引物的擴增率88％，3對引物擴增率75％，5對引物擴增效率為62％，2對引物擴增效率為50％，2對引物擴增效率為40％，其中1對引物擴增出的帶型為單一條帶即為單態(tài)性，其它14對均為多態(tài)性.篩選出的引物信息如表1.

M) 25bp ladder；125,126,128,131)依次為：UDK-125,UDK-126,UDK-128,UDK-131

表1 軟棗獼猴桃SSR分子標記可用引物序列和退火溫度

2.3 篩選引物在雅安天全二郎山軟棗獼猴桃群體樣本中的驗證

用篩選出的15對引物對二郎山軟棗獼猴桃的15個單株樣品進行SSR分析(見表2)，每對引物都能擴增，總共擴增141個等位基因，平均等位基因數(shù)為9.4個，2對引物中有亞等位基因，擴增的等位基因數(shù)最多的18個，最少的2個，平均PIC值為0.745.引物UDK-125擴增的片段最長，引物UDK-099擴增的片段最短.同一個樣品在不同的引物中，等位基因數(shù)變變異較大，最低有5個不同的等位數(shù)，最多8個不同等位基因數(shù)；而同一個引物在不同樣品中，等位基因數(shù)變化范圍較小.

表2 二郎山15個樣品的SSR分析

篩選出的15對引物通過treev32軟件對天全二郎山15個個體作個體聚類NJ樹(見圖5)，可將雅安天全二郎山15個個體分成三大組；TYA-11、1、8、5可聚為第一組，TYA-13、17、15、3、10、20、19可聚為第二組，TYA-6、18、9、16可聚為第三組；在第一組中TYA-8與TYA-5距離較近，第二組中的TYA-17與TYA-15，TYA-3與TYA-10，TYA-20與TYA-19之間的距離較近，第三組中TYA-6與TYA-18，TYA-9與TYA-16之間的距離較近；可推測這些距離較近的個體間親緣關(guān)系較近.

圖5 二郎山15個個體的聚類NJ樹

3 討論

由于軟棗獼猴桃葉片中含有較多的糖分，用傳統(tǒng)的CTAB法不能提取高質(zhì)量的DNA.本文在傳統(tǒng)CTAB提取DNA的過程中有所改進，在研磨樣品以后不直接加入CTAB，而是先加入山梨醇洗液，盡量將葉片中釋放的糖分去掉，之后再加入CTAB裂解液，再回到傳統(tǒng)的步驟上[8].改進后提取的軟棗獼猴桃基因組DNA條帶清晰，沒有明顯拖尾，后期做SSR擴增反應(yīng)過程中，效果較好.

Testolin 等[9]利用中華獼猴桃基因組篩選出一批SSR引物最初用于遺傳作圖.根據(jù)前期已經(jīng)報道的從中華獼猴桃到軟棗獼猴桃SSR引物具有較高的通用性.本研究從來自不同地理居群中的少量樣本提取DNA，利用Testolin等[9]開發(fā)的中華獼猴桃65對SSR引物進行擴增，用瓊脂糖膠篩選出在多數(shù)樣本中有擴增條帶的引物32對，再利用6％的聚丙烯酰胺凝膠電泳進行篩選，得到有效引物引物15對，其中2對引物中有亞等位基因，1對引物具有單態(tài)性.本研究獲得的數(shù)據(jù)顯示，從中華獼猴桃到軟棗獼猴桃，基因組SSR引物的通用性為23％,而在Man等[7]研究得出兩個物種間SSR引物通用性可達到42％，該差異可能是由于軟棗獼猴桃野生居群的遺傳差異或者各自檢測的SSR在基因組上的分布差異所致. 篩選出的15對引物通過treev32軟件對天全二郎山15個個體作個體聚類NJ樹，可將這些個體分成三大組及六個不同的小組，從而清楚的得出個體與個體之間的親緣關(guān)系.在軟棗獼猴桃基因組還未測序的前提下，可使用目前已經(jīng)公布的中華獼猴桃EST庫和新近公布的“紅陽”基因組序列[9]，開發(fā)出大量可用于軟棗獼猴桃資源評價及遺傳鑒定的可用標記.

本文在二郎山群體測試的平均PIC值為0.745，甚至高于Korkovelos等[10]在不同物種水平的PIC值，這可能是由于后者研究選擇的引物少(8對)所致，某些SSR片段屬于基因組中變異極高的區(qū)段，即使在物種內(nèi)居群水平上也具有很高的多態(tài)性，故選擇不同引物也必然會導致多態(tài)性變化.

由黃岳等[5]對長白山局部取樣的軟棗獼猴桃的RAPD分析可知，長白山地區(qū)的軟棗獼猴桃多樣性較高[5].本文利用SSR標記對四川天全二郎山地區(qū)的野生軟棗獼猴桃進行分析，獲得的多樣性指數(shù)較高，說明我國東北地區(qū)和西南地區(qū)軟棗獼猴桃資源的遺傳多樣性均較高，但由于采用的標記不同，無法平行比較，需要對跨區(qū)域居群樣本進一步統(tǒng)一分析，才能了解各地區(qū)軟棗獼猴桃資源遺傳多樣性水平.此外，對我國軟棗獼猴桃資源的遺傳評價研究中還需要進一步擴大居群數(shù)量和取樣范圍，以獲得更準確的結(jié)論.

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