王 政， 姚銀安

(1.江蘇大學(xué)生命科學(xué)研究院， 鎮(zhèn)江 212013； 2.中科院新疆生態(tài)與地理研究所， 烏魯木齊 830011)

甘藍(lán)型油菜(Brassicanapus)是中國最重要的油料作物，其所產(chǎn)菜籽油占中國食用植物油供應(yīng)的50%。油菜菌核病(Sclertiniasclerotiorum(Lib.)de Bary)是限制中國油菜生產(chǎn)的主要因子之一。S.sclerotiorum是一種死體營養(yǎng)型病原菌[1]，它導(dǎo)致中國油菜產(chǎn)量損失高達(dá)30%，嚴(yán)重時達(dá)到50%～80%。然而，人們對油菜菌核病的抗病分子機(jī)制尚不清楚。

植物對病原菌的抗性表現(xiàn)在多個方面和多個層次。當(dāng)病原菌突破植物預(yù)制型防衛(wèi)機(jī)制后，可誘導(dǎo)防衛(wèi)機(jī)制發(fā)揮重要的抗病作用。這些誘導(dǎo)型防衛(wèi)反應(yīng)在植物體內(nèi)由多種信號分子介導(dǎo)，其中，素茉莉酸(Jasmonic acid, JA)和乙烯(Ethylene, ET)是植物重要的防衛(wèi)反應(yīng)信號分子[2]。

JA和ET廣泛存在于植物體中。如圖1所示，茉莉酸在植物體中是經(jīng)過十八碳途徑(octadecanoid pathway)合成而來，其關(guān)鍵合成酶為脂氧合酶(lipoxygenase, LOX)和丙二烯氧合酶(allene oxide synthase, AOS)[3]；ET合成的關(guān)鍵限速步驟是從S-腺苷甲硫氨酸到(S-adenosyl methionine) 到1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸 (1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid, ACC) 的轉(zhuǎn)化，這一過程由ACC氧化酶(ACS)催化而成，因此，ACS是乙烯合成的關(guān)鍵酶[4]。JA 和ET可以協(xié)同介導(dǎo)許多防御相關(guān)基因如PDF1.2 (plant defensin 1.2)和HEL(hevein-like protein gene, also called pathogenesis-related gene 4)的表達(dá)，在擬南芥-病原菌的相互作用中已被廣泛的研究[5-8]。

圖1 JA 和ET在植物體的合成途徑(參考文獻(xiàn)[9-10])

在油菜中，研究已經(jīng)顯示過表達(dá)JA和ET的正調(diào)控因子BnMPK的轉(zhuǎn)基因植株顯著提高菌核病抗性[11]；基于擬南芥基因組芯片的研究結(jié)果也顯示，油菜受到菌核病侵染時，JA信號途徑中的基因表達(dá)發(fā)生顯著改變[12]。這些結(jié)果暗示，JA和ET介導(dǎo)的信號反應(yīng)在油菜抗菌核病中可能扮演著重要的作用，然而，這些研究缺乏JA和ET信號反應(yīng)相關(guān)于S.sclerotiorum侵染的在油菜中的直接數(shù)據(jù)。

本研究應(yīng)用擬南芥JA和ET關(guān)鍵合成基因和信號途徑標(biāo)志基因在油菜中的同源基因，在兩個不同菌核病抗性的油菜品種中比較分析這些基因的S.sclerotiorum誘導(dǎo)表達(dá)譜，為更好地理解JA和ET信號反應(yīng)在油菜抵抗S.sclerotiorum侵染中的作用提供直接數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘藍(lán)型油菜品種中雙九號(菌核病抗病品種)和84039(菌核病高感品種)、大腸桿菌(Escherichiacoli) DH5α菌株來自于本實驗室；核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)菌核采自大田油菜莖桿。TRIzol RNA 提取試劑為Invitrogen產(chǎn)品，DNase1(RNase-free)，逆轉(zhuǎn)錄酶(M170A)為Promega產(chǎn)品；SYBR Green Realtime PCR Master Mix為TOYOBO產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

蛋白核酸檢測儀為DU 650 BECKMAN，USA；熒光定量PCR儀為RTTM-Cycler(博奧)。

1.3 方法

1.3.1 植株培養(yǎng)

油菜種子在25℃催芽后，選露白種子播于9cm×9cm的缽中，溫室中土培(土∶蛭石=5∶1)，光周期為：16 h光照(25℃)/8 h黑暗(20℃)，相對濕度70%左右。

1.3.2 RNA 的提取及cDNA的制備

根據(jù)Trirol RNA提取試劑盒的操作進(jìn)行總RNA提取。用蛋白核酸檢測儀(DU 650 BECKMAN，USA)結(jié)合1.2%瓊脂糖變性膠凝膠電泳結(jié)果測算RNA純度和濃度。

按照Promega公司逆轉(zhuǎn)錄酶(M170A)的操作說明進(jìn)行cDNA的制備。體系含有2 μg RNA，1 μL Oligo(dT)，4 μL 的5×MMLV Reaction Buffer，1 μL的 dNTP(10mmol/L)，RNase 抑制劑20 U，MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U。然后用DEPC水補(bǔ)至20 μL，混勻，42℃溫育1 h，70℃水浴15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

1.3.3 核盤菌接菌

當(dāng)油菜幼苗長到四葉一心期進(jìn)行核盤菌接菌，接菌前4～5 d將植株進(jìn)行23℃恒溫培養(yǎng)。菌核在PDA平板上于22℃靜置培養(yǎng)3～4 d，當(dāng)菌核即將鋪滿平板時，用φ5 mm打孔器沿菌絲外緣打孔，取菌絲塊，用于接種，對照用無菌培養(yǎng)基塊。

上述不同處理后，分別在0、6 h、24 h、72 h將葉片剪下，錫箔紙包裹，用液氮速凍后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存。

1.3.4 化學(xué)處理

用96%乙醇配制成0.1 mM MeJA的MeJA處理液；用滅菌雙蒸水配制成1 mM ACC的ACC處理液。分別用這兩種處理液噴霧處理四葉一心期的油菜品種中雙號9離體葉片，MeJA處理以不含MeJA的乙醇溶液為對照(CK1)；ACC處理以滅菌雙蒸水為對照(CK2)。處理12 h后取樣。

1.3.5 定量RT-PCR

定量RT-PCR方法：參照SYBR?Green Realtime PCR Master Mix-Plus-試劑盒(Takara)，采用B.napusactin作為內(nèi)標(biāo)基因，引物由上海生工合成，基因引物序列信息見表1。

表1 熒光定量RT-PCR引物序列

熒光定量反應(yīng)體系為20 μL：含有SYBR Mix 10 μL，正反向引物(10 μ mol/L)各0.8 μL，模板2 μL和DEPC處理過的無菌水。反應(yīng)程序為：94℃、5min；94℃、15 s，55℃、20 s，72℃、30 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后先加熱到95℃，然后降至72℃，再緩慢升溫至95℃，記錄熒光信號的變化，得出擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線。進(jìn)行3次重復(fù)實驗。按照2-ΔΔCt方法對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并且求出系統(tǒng)誤差[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘藍(lán)型油菜茉莉酸關(guān)鍵合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

圖2 茉莉酸合成基因的菌核病誘導(dǎo)表達(dá)

為了調(diào)查油菜中茉莉酸合成關(guān)鍵基因的菌核病誘導(dǎo)表達(dá)，本實驗從NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索它們在油菜中的同源基因BnAOS和BnLOX2基因序列，設(shè)計引物，運用定量RT-PCR進(jìn)行S.sclerotiorum誘導(dǎo)表達(dá)分析。如圖2所示，BnLOX2和BnAOS在兩個品種中均被S.sclerotiorum的侵染快速誘導(dǎo)，在接種24 h時達(dá)到最大，顯示出這兩個基因有相似的表達(dá)圖譜，表明S.sclerotiorum的侵染能夠快速誘導(dǎo)油菜防衛(wèi)信號分子JA水平的增加。同時，在S.sclerotiorum接種24 h時，這兩個基因在抗病品種中的相對表達(dá)量顯著高于感病品種。

2.2 甘藍(lán)型油菜乙烯關(guān)鍵合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

當(dāng)用S.sclerotiorum接種12 h時，乙烯合成關(guān)鍵基因BnACS2在兩個品種中均被快速表達(dá)，在接種24 h時達(dá)到最大，同時在接種12 h和24 h時，BnACS2在抗病品種中的相對表達(dá)量顯著高于感病品種(圖 3)。這些結(jié)果表明，S.sclerotiorum的侵染能夠啟動油菜體內(nèi)乙烯快速的合成。

圖3 乙烯合成基因的菌核病誘導(dǎo)表達(dá)

2.3 JA/ET信號途徑標(biāo)志基因的誘導(dǎo)表達(dá)分析

基于JA和ET關(guān)鍵合成基因的誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果，本研究進(jìn)一步調(diào)查JA和ET介導(dǎo)的信號途徑是否被S.sclerotiorum激活，因此JA/ET信號途徑的標(biāo)志基因BnPDF1.2和BnHEL的S.sclerotiorum誘導(dǎo)表達(dá)被調(diào)查。如圖4所示，在S.sclerotiorum接種12 h時，在兩個品種中BnPDF1.2的表達(dá)顯著增加，在24 h達(dá)到最大；而BnHEL在S.sclerotiorum接種24 h時顯著誘導(dǎo)表達(dá)；同時，在接種24 h和48 h時，這兩個基因在抗病品種中的相對表達(dá)量顯著高于感病品種。這些結(jié)果進(jìn)一步表明S.sclerotiorum的侵染能夠激活油菜JA和ET介導(dǎo)的防衛(wèi)信號反應(yīng)。

2.4 JA和ET功能類似物MeJA和ACC的藥理學(xué)實驗

以上結(jié)果顯示，JA和ET防衛(wèi)信號反應(yīng)在S.sclerotiorum誘導(dǎo)表達(dá)中被協(xié)同激活。為了解釋這一現(xiàn)象，本研究應(yīng)用藥理學(xué)實驗即用JA和ET的功能類似物MeJA和ACC處理油菜，然后使用qRT-PCR方法調(diào)查信號基因的表達(dá)情況。正如圖5所示，MeJA的處理不僅能夠激活信號基因BnPDF1.2和BnHEL的表達(dá)，而且顯著提高JA和ET合成基因BnLOX2、BnAOS和BnACS2的表達(dá)；同時，ACC除了BnPDF1.2和BnHEL的表達(dá)之外，也顯著提高BnAOS和BnACS2的表達(dá)。這些結(jié)果表明，JA和ET信號反應(yīng)能夠相互促進(jìn)，并且JA和ET信號反應(yīng)本身存在自我放大的功能。

圖4 茉莉酸和乙烯信號途徑標(biāo)志基因的菌核病誘導(dǎo)表達(dá)

圖5 MeJA 和 ACC 的藥理學(xué)實驗

3 討論

JA和ET防衛(wèi)信號途徑已經(jīng)在各種植物-病原系統(tǒng)中進(jìn)行了研究，但是對于油菜-菌核病這一重要的寄主——病原菌系統(tǒng)，有關(guān)它們的研究還未系統(tǒng)展開。本實驗的結(jié)果顯示，S.sclerotiorum不僅能夠誘導(dǎo)油菜JA和ET合成途徑關(guān)鍵基因BnAOS、BnLOX2和BnACS2的表達(dá)，而且也激活了JA和ET信號途徑的標(biāo)志基因BnPDF1.2和BnHEL的表達(dá)，這些結(jié)果說明S.sclerotiorum對油菜的侵染激活了JA和ET防衛(wèi)信號反應(yīng)。同時顯示，這兩個信號反應(yīng)激活在抗病品種比在感病中更為有效，這進(jìn)一步說明這兩個信號反應(yīng)在油菜抗S.sclerotiorum的侵染中發(fā)揮作用。

一個運用擬南芥基因序列RT-PCR的結(jié)果顯示，S.sclerotiorum侵染導(dǎo)致JA反應(yīng)基因WRKY33和WRKY40在油菜抗病品種中的表達(dá)顯著高于在感病品種中的表達(dá)[14]；基于基因組芯片的研究結(jié)果也顯示，菌核病侵染油菜激活了JA信號途徑中基因的表達(dá)[12]；進(jìn)而，過表達(dá)JA和ET信號途徑的正調(diào)控因子BnMPK4顯著提高油菜菌核病抗性[11]；同時，擬南芥對死體營養(yǎng)性病原菌灰霉病(Botrytiscinerea)和黑斑病(Alternariabrassicicola)的抗性依賴于JA和ET信號反應(yīng)[15-16]，這些結(jié)果與本研究共同支持了一個觀點即JA/ET信號防衛(wèi)途徑在植物抗死體營養(yǎng)性病原菌中具有重要的作用[2]。

本研究的藥理學(xué)實驗結(jié)果顯示油菜中存在ET、JA信號反應(yīng)的自我放大效應(yīng)以及兩者之間的相互促進(jìn)作用，這很好地解釋了油菜中JA和ET防衛(wèi)信號反應(yīng)在S.sclerotiorum誘導(dǎo)表達(dá)中的協(xié)同激活效應(yīng)。這個結(jié)果類似于A.brassicicola侵染擬南芥中ET 和 JA信號反應(yīng)的基因表達(dá)圖譜[17]；另外，如圖3所示，我們也注意到S.sclerotiorum接種后，ET的合成基因BnASC2在抗病品種中在12 h就被顯著激活，先于JA和ET信號反應(yīng)在24 h的激活最高點，這一數(shù)據(jù)建議ET和JA信號的激活可能具有順序性而非平行的關(guān)系。在擬南芥的研究也顯示，ET能夠解除JA信號的體內(nèi)阻遏，暗示ET信號的激活可能早于JA信號[18]。因而，我們推測S.sclerotiorum的侵染首先使得體內(nèi)ET含量的升高，然后通過自我放大環(huán)以及ET對JA信號的促進(jìn)作用，使得JA和ET信號反應(yīng)在接種24 h快速地達(dá)到激活最高點(圖4)。然而這需要進(jìn)一步實驗研究。

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