呂慎金，楊 燕，魏萬(wàn)紅

(1.臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，臨沂 276005;2.揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009;3.臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，臨沂 276012)

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，近年來(lái)許多學(xué)者將動(dòng)物的數(shù)量性狀與基因進(jìn)行關(guān)聯(lián)性分析，以篩選候選基因［1］。動(dòng)物的行為也受到基因的控制，將動(dòng)物行為與基因型進(jìn)行相關(guān)性分析，不但可以了解行為表達(dá)的機(jī)制，也可以更為深刻的了解如何操作與控制動(dòng)物行為，以更好的為人類和改善動(dòng)物福利服務(wù)［2］，而有關(guān)該方面的研究正處于探索之中。李劍虹等曾利用SNP方法對(duì)大白、長(zhǎng)白和杜洛克豬的Kappa阿片(OPRK1)受體進(jìn)行分析，結(jié)果表明Kappa阿片受體基因SNP對(duì)母豬靜止站立行為性狀存在一定影響［3］。對(duì)嗜酒(alcoholpreferring)和厭酒小鼠(alcohol-avoiding)的OPRK1基因多態(tài)性分布研究結(jié)果表明，在BALB/cJ厭酒小鼠OPRK1啟動(dòng)子區(qū)發(fā)現(xiàn)突變序列，而另外C57BL/6ByJ和CXBI兩種小鼠沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)，但其腦中mRNA表達(dá)水平不同［4］。

應(yīng)激行為能引起機(jī)體分泌多種內(nèi)源性阿片肽［5］。目前發(fā)現(xiàn)并克隆了3種阿片受體，分別為Kappa受體［6］、Mu 受體［7］和 Delta受體［8］。Kappa阿片受體又稱作 OPRK1(Kappa Opoioid Receptor 1)基因，屬于 G 蛋白偶聯(lián)受體家族成員。研究表明OPRK1阿片受體主要分布在與痛覺(jué)、情緒、行為等有關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)區(qū)域，對(duì)動(dòng)物的神經(jīng)反應(yīng)和行為表現(xiàn)有重要影響［9-10］。內(nèi)源性阿片肽與不同的受體結(jié)合，參與表達(dá)性格、情緒、種屬生存行為等一些基本反應(yīng)，也對(duì)傷害性刺激、應(yīng)激、獎(jiǎng)賞等有不同的反應(yīng)［7］。梅花鹿(Cervus nippon)屬于哺乳綱(Mammalia)、偶蹄目(Artiodactyla)、鹿科(Cervidae)、花鹿屬(Cervus)。我國(guó)梅花鹿共6個(gè)亞種:東北亞種(C.n.hortulorum)、華南亞種(C.n.kopschi)、四川亞種(C.n.sinchuanicus)、臺(tái)灣亞種(C.n.taiouanus)、山西亞種(C.n.grassianus)和華北亞種(C.n.mandarinus)［11］。目前，野生梅花鹿僅存3個(gè)亞種，都被列為國(guó)家Ⅰ級(jí)保護(hù)動(dòng)物［12］。人工飼養(yǎng)梅花鹿品系基本是在東北亞種的基礎(chǔ)上選育而成［13］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)對(duì)圈養(yǎng)梅花鹿報(bào)道主要集中在飼養(yǎng)繁殖、疾病防治、鹿茸生產(chǎn)等方面，對(duì)梅花鹿的行為學(xué)、遺傳學(xué)研究也有報(bào)道［14-16］，而OPRK1基因多態(tài)性和梅花鹿晝間行為性狀是否相關(guān)尚無(wú)報(bào)道。因此，本研究以PCR-SSCP技術(shù)為手段，分析了OPRK1基因在梅花鹿中的單核苷酸多態(tài)性，驗(yàn)證基因多態(tài)性和動(dòng)物行為性狀是否相關(guān)，為進(jìn)一步研究候選基因在動(dòng)物行為遺傳特性方面提供理論基礎(chǔ)，也為與行為性狀相關(guān)基因的篩選提供途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究梅花鹿來(lái)自揚(yáng)州市動(dòng)物園和揚(yáng)州市平山堂養(yǎng)殖場(chǎng)兩地((119°26'E，32°24'N))。兩地均處于亞熱帶南部季風(fēng)氣候區(qū)，四季分明，年平均氣溫15.4℃，最冷月1月的平均氣溫1.8℃，最熱月7月的平均氣溫為27.5℃。日照2 113 h，無(wú)霜期238 d，年降水量1 020 mm。平山堂養(yǎng)殖場(chǎng)位于揚(yáng)州市瘦西湖景區(qū)，該場(chǎng)占地面積約1 500 m2，共4個(gè)半敞開(kāi)式圈舍，每個(gè)圈舍面積20 m×10 m，共觀測(cè)記錄25只成年梅花鹿(♂15只，♀10只)。江蘇省揚(yáng)州市動(dòng)物園位于揚(yáng)州市郊區(qū)灣頭鎮(zhèn)，該園占地面積約52.6 hm2，梅花鹿個(gè)體散放公園食草區(qū)內(nèi)(100 m×50 m)，共觀測(cè)記錄23只(♂13只，♀10只)。兩地梅花鹿飼喂時(shí)間均為每天8:00和15:00左右各1次。食物主要為白三葉(Trifolium repens)、紫花苜蓿(Medicago sativa)和其它青草，補(bǔ)充精料為配合飼料，飼料主成分為玉米、豆粕、麩皮、食鹽及多種維生素、礦物質(zhì)、微量元素等。

1.2 研究方法

1.2.1 行為性狀觀察

首先對(duì)兩地梅花鹿個(gè)體進(jìn)行辨識(shí)，利用耳標(biāo)、角的形狀、身體上的斑痕及個(gè)體大小等體型外貌特征區(qū)分梅花鹿個(gè)體。

在正式觀察之前進(jìn)行為期7 d的預(yù)觀察，確定動(dòng)物的行為格局和記錄方法，并對(duì)觀察者進(jìn)行培訓(xùn)。正式觀察時(shí)間為2006年7—12月及2007年2—6月，每周觀察4 d。采用目標(biāo)動(dòng)物取樣法每天8:30—16:30在距離動(dòng)物5—15 m處對(duì)動(dòng)物的行為進(jìn)行觀察。觀察時(shí)1人觀察口述，1人記錄，每2 h輪換1次。根據(jù)梅花鹿生理特點(diǎn)以及前人研究結(jié)果［17］，將梅花鹿行為參數(shù)定義如下:

取食 梅花鹿的上下唇協(xié)同動(dòng)作，對(duì)青草、飼料等食物進(jìn)行切割、咀嚼、吞咽的過(guò)程，若梅花鹿在移動(dòng)過(guò)程中有上述動(dòng)作發(fā)生，仍將其視為取食行為;反芻 梅花鹿在非睡眠時(shí)，頭部高于背中線，對(duì)食物進(jìn)行逆嘔、咀嚼等過(guò)程，反芻分站立反芻和臥倒反芻;臥息 梅花鹿的臥息包括休息、淺睡和睡眠，臥下時(shí)，前肢先跪下，后肢下蹲，接著腹部著地，最后臀部觸地，臥姿分為左側(cè)臥和右側(cè)臥;

觀望 梅花鹿頭昂起，耳朵朝有異響或異樣方向轉(zhuǎn)動(dòng)，四肢靜止不動(dòng)，情況危急時(shí)則尾巴翹起，用力踏地;移動(dòng) 梅花鹿從一地點(diǎn)到另外一地點(diǎn)的動(dòng)作，移動(dòng)包括走動(dòng)和跑動(dòng)，以走動(dòng)為主;

修飾 梅花鹿為求得舒適而進(jìn)行的自潔行為及排除蚊蠅干擾或?qū)ι眢w某些部位進(jìn)行舔舐、輕咬、蹭墻、搔扒等行為;

其它 梅花鹿的飲水、排尿、排糞、嬉戲、鳴叫等。觀測(cè)過(guò)程中，如果由于天氣等原因不能觀測(cè)，則在1周內(nèi)補(bǔ)充觀測(cè)。

由于動(dòng)物園梅花鹿受游客影響較大，因此周末以及國(guó)家法定節(jié)日期間單獨(dú)觀測(cè)統(tǒng)計(jì)［18］。觀測(cè)結(jié)束后，對(duì)行為記錄數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，錄入計(jì)算機(jī)進(jìn)行分析。

1.2.2 血樣采集

梅花鹿麻醉后頸靜脈采血5—10 mL，置于15 mL指型管中(內(nèi)置1—2.5 mL裂解液)，充分搖動(dòng)至血細(xì)胞完全破裂，溶液呈粘稠狀為止。兩地共采集樣本48份，其中，揚(yáng)州市平山堂養(yǎng)殖場(chǎng)共采集血樣25份(♂15只，♀10只);動(dòng)物園采集樣本23份(♂13只，♀10只)，并做好詳細(xì)的個(gè)體信息登記。

1.2.3 引物信息

應(yīng)用Primer 5.0軟件，根據(jù)GenBank中收錄有關(guān)OPRK1基因序列NC_007312、NW_00149302設(shè)計(jì)9對(duì)引物(表1)。各引物均由上海生工科技有限公司合成。引物稀釋過(guò)程分2步進(jìn)行:首先稀釋為正常擴(kuò)增的10倍濃度，-20℃長(zhǎng)期保存;使用時(shí)再稀釋10倍，作為正常使用的引物濃度。

1.2.4 最佳PCR擴(kuò)增體系

PCR 反應(yīng)體系為 20 μL，其中 0.20 μL(5U/μL)Taq 酶，2.20 μL 10×buffer(含 Mg2+)，1.20 μL 濃度為1 μmol/L引物，1.20 μL濃度為2.0 mmol/L dNTPs，1.40 μL濃度為50 ng/L基因組DNA，最后用去離子滅菌水補(bǔ)齊至20 μL體系。PCR反應(yīng)程序如下:94℃預(yù)變性5 min，然后94℃變性45 s，54—56℃退火40 s，72℃延伸30 s，共33個(gè)循環(huán)。72℃延伸5 min，產(chǎn)物4℃保存。

表1 梅花鹿OPRK1基因引物信息Table 1 Information of primers for sika deer with OPRK1 gene

1.3 分析方法

建立模型:

式中，yij為行為性狀觀測(cè)值;u為群體均值;Ii為第i基因型效應(yīng)值;eij為隨機(jī)誤差。應(yīng)用SPSS軟件一般線性模型，對(duì)不同基因型與行為性狀的關(guān)系進(jìn)行比較分析。所有動(dòng)物行為性狀以8 h統(tǒng)計(jì)記錄，以行為持續(xù)時(shí)間(M±S.E.)為觀測(cè)變量，以不同基因型作為另一變量，輸入SPSS軟件分析系統(tǒng)，即可進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA提取及PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

從梅花鹿血樣中提取的基因組DNA溶于300 μL TE中，室溫溶解24 h后用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。結(jié)果表明提取的基因組沒(méi)有降解，條帶較均勻一致，所含DNA符合生物學(xué)試驗(yàn)要求(圖1)。在設(shè)計(jì)的9對(duì)引物中，只有位于第二內(nèi)含子引物P-5和第三外顯子的P-9引物獲得擴(kuò)增產(chǎn)物(圖2)。對(duì)引物P-5進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表現(xiàn)3種基因型，分別命名為EE、EF、FF(圖3)。對(duì)引物P-9進(jìn)行SSCP分析，結(jié)果表現(xiàn)3種基因型，分別命名為 GG、GH、HH(圖4)。

圖1 梅花鹿基因組DNAFig.1 The genome DNA of sika deer

圖2 引物P-9 PCR產(chǎn)物檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Result of agrose gel electrophoresis for PCR product of primer P-9

圖3 引物P-5多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Result of polymorphism amplified by primer P-5

圖4 引物P-9多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Result of polymorphism amplified by primer P-9

2.2 OPRK1基因測(cè)序結(jié)果及同源性分析

將引物P-5所得EE、FF 2個(gè)基因型，引物P-9所得GG、HH兩個(gè)基因型的克隆產(chǎn)物直接進(jìn)行正反測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，P-5引物獲得序列與牛同源性達(dá)到97%，P-9引物與牛的同源性達(dá)到99%，因此可確定所獲基因序列為梅花鹿序列。通過(guò)測(cè)序圖比對(duì)發(fā)現(xiàn)引物P-5擴(kuò)增片段在DNA序列72bp處發(fā)生G→A突變(圖5)，引物P-9擴(kuò)增產(chǎn)物在132bp處發(fā)生T→A的突變(圖6)。但氨基酸比較表明這兩處突變均為沉默突變。

圖5 OPRK1基因引物P-5擴(kuò)增片段2個(gè)基因型序列比對(duì)Fig.5 The sequence alignment of two gene types amplified by primer P-5

圖6 OPRK1基因引物P-9擴(kuò)增片段的基因型序列比對(duì)Fig.6 The sequence alignment of gene types amplified by primer P-9

2.3 OPRK1基因的遺傳學(xué)分析

在梅花鹿兩個(gè)群體中，對(duì)OPRK1引物P-5和P-9的基因頻率和基因型頻率進(jìn)行檢測(cè)分析(表2)，在OPRK1基因引物P-5擴(kuò)增結(jié)果中檢測(cè)3種基因型，其中EE型基因型頻率最高，而EF和FF型基因型頻率相等，適合性χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明梅花鹿在該位點(diǎn)處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P＜0.01)。在OPRK1基因引物P-9擴(kuò)增結(jié)果中也檢測(cè)到3種基因型，其中純合子HH的基因型頻率最高，GG基因型頻率最低，適合性χ2檢驗(yàn)結(jié)果表明，梅花鹿在該位點(diǎn)也處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)(P＜0.01)。

表2 OPRK1基因各引物等位基因頻率和基因型頻率及Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Table 2 Alleles and genotype frequency and equilibrium test of Hardy-Weinberg for OPRK1 gene

2.4 OPRK1基因多態(tài)性與行為性狀的關(guān)系

對(duì)OPRK1基因SNP位點(diǎn)基因型與梅花鹿各行為性狀進(jìn)行最小二乘分析，P-5引物基因型對(duì)梅花鹿修飾行為有極顯著影響(P＜0.01)，對(duì)其余各行為無(wú)顯著影響。引物P-9各基因型對(duì)觀望行為有極顯著影響(P＜0.01)，對(duì)臥息和修飾行為有顯著影響(P＜0.05)，對(duì)其余行為性狀均無(wú)顯著影響。

進(jìn)一步對(duì)不同基因型各行為性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較(表3)。引物P-5各基因型間修飾行為EE型、FF型和EF型之間兩兩差異顯著(P＜0.05)，其中FF型行為持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)為15 min左右，EE型行為持續(xù)時(shí)間最短為3 min左右。在所觀測(cè)的7種行為性狀中，其它行為EE型和FF型差異顯著(P＜0.05);而另外5種行為性狀在各個(gè)基因型中沒(méi)有檢測(cè)到顯著差異。引物P-9各基因型間臥息行為GG型比GH型個(gè)體行為持續(xù)時(shí)間平均高近90 min，且兩者之間差異顯著;觀望行為GG型、HH型和GH型3種基因型個(gè)體的行為持續(xù)時(shí)間依次升高，且GH型比GG型高4倍，3種基因型之間兩兩差異顯著(P＜0.05)，但GH和GG兩種基因型之間存在極顯著差異(P＜0.01);修飾行為HH型比GG型和GH型個(gè)體行為持續(xù)時(shí)間都高4 min多，且HH型和另外兩者存在顯著差異(P＜0.05)。

表3 OPRK1基因不同基因型在梅花鹿中各行為性狀比較(分鐘)Table 3 Comparison for behavior traits of each genotype of OPRK1 in sika deer(min)

3 討論

3.1 群體平衡的遺傳學(xué)分析

本研究中，在OPRK1基因引物P-5及P-9擴(kuò)增結(jié)果中都檢測(cè)到3種基因型，且梅花鹿在這兩個(gè)位點(diǎn)均處于Hardy-Weinberg不平衡狀態(tài)。群體不平衡可能是由于基因的遺傳漂變或選擇、選配等因素所致［19］。遺傳漂變即在有限群體中由于取樣誤差造成了基因頻率的隨機(jī)波動(dòng)，其產(chǎn)生因素有始祖效應(yīng)、小群體效應(yīng)及瓶頸效應(yīng)。而群體育種規(guī)模較小，導(dǎo)致群內(nèi)個(gè)體間不能隨機(jī)交配是目前養(yǎng)殖業(yè)普遍存在的現(xiàn)象，引種、雜交、分群、近交等都會(huì)引起基因遺傳漂變現(xiàn)象的發(fā)生。群體越小，等位基因頻率改變的幾率越大，低頻率基因向下漂變的可能性就越大［20］。本研究中樣本量較小，這是造成檢測(cè)群體處于不平衡狀態(tài)的重要原因。結(jié)論也可能說(shuō)明兩地梅花鹿群體在飼養(yǎng)管理過(guò)程中該位點(diǎn)一直受到選擇的影響;同時(shí)分析可知，長(zhǎng)期的群體內(nèi)閉鎖繁育也可導(dǎo)致群體處于不平衡狀態(tài)。所以要保持現(xiàn)有梅花鹿群體基因頻率不變，保存現(xiàn)有基因資源，對(duì)梅花鹿群體選育時(shí)首先要考慮防止遺傳漂變現(xiàn)象的發(fā)生;同時(shí)要考慮選擇、選配對(duì)群體基因頻率的影響，結(jié)合當(dāng)前行業(yè)發(fā)展趨勢(shì)及實(shí)際生產(chǎn)要求，在群體有足夠大規(guī)模時(shí)，進(jìn)行雜交、近交及人工選配。

3.2 OPRK1基因多態(tài)性與行為性狀的關(guān)聯(lián)分析

對(duì)OPRK1基因引物P-5和P-9不同基因型各行為性狀的最小二乘均值進(jìn)行多重比較可知，引物P-5各基因型間修飾行為差異顯著，在所觀測(cè)的7種行為性狀中，其它行為EE型和FF型差異顯著。P-9引物獲得基因型在兩地梅花鹿行為性狀分析中，臥息行為之間差異極顯著;觀望行為的3種基因型個(gè)體的行為持續(xù)時(shí)間依次升高，且3種基因型之間兩兩差異顯著(P＜0.05);修飾行為也存在顯著差異(P＜0.05)。李劍虹等曾利用SNP方法對(duì)大白、長(zhǎng)白和杜洛克豬的Kappa阿片(OPRK1)受體進(jìn)行分析，結(jié)果表明Kappa阿片受體基因SNP對(duì)母豬靜止站立行為性狀存在一定影響［3］。有研究報(bào)道Kappa阿片受體基因敲除的小鼠對(duì)激動(dòng)劑的鎮(zhèn)痛作用消失，運(yùn)動(dòng)減少和煩躁不安的作用也顯著降低［21。Kappa阿片受體也參與腦內(nèi)系統(tǒng)神經(jīng)回路的活動(dòng)，系統(tǒng)神經(jīng)回路上的神經(jīng)遞質(zhì)(包括多巴胺和阿片肽)通過(guò)調(diào)節(jié)特定的靶神經(jīng)元群的活動(dòng)，從而作為一系列行為如學(xué)習(xí)、記憶、睡眠、攝食、飲水、性行為、攻擊等行為和情緒變化的物質(zhì)基礎(chǔ)［22］。同樣在小鼠上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了Kappa阿片受體基因的多態(tài)性［4］。本研究表明，OPRK1基因引物P-5也檢測(cè)到基因多態(tài)性，且不同基因型之間對(duì)梅花鹿的修飾行為產(chǎn)生一定作用，P-9位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物分析表明，其不同基因型對(duì)臥息、觀望行為也產(chǎn)生顯著影響。同樣以BDNF為目的基因?qū)γ坊谷粘Ｐ袨樾誀钸M(jìn)行研究的結(jié)果表明，不同基因型之間對(duì)梅花鹿的臥息及運(yùn)動(dòng)行為有顯著差異［23］，因此，初步認(rèn)為本研究結(jié)果和文中所述有相似之處。

動(dòng)物行為是一個(gè)復(fù)雜的生物現(xiàn)象，其行為性狀是長(zhǎng)期的自然選擇和人工選擇的產(chǎn)物，本研究選擇OPRK1作為影響梅花鹿行為性狀的候選基因，采用SNP方法分析該基因部分外顯子序列單核苷酸位點(diǎn)突變和行為性狀的關(guān)系，結(jié)論表明OPRK1基因可能和梅花鹿的臥息與觀望行為存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，初步認(rèn)為GG型可能和動(dòng)物臥息行為相關(guān)，GH可能和動(dòng)物的觀望行為有關(guān)。李劍虹等把豬長(zhǎng)時(shí)間靜止站立確定為是一種動(dòng)物“規(guī)癖行為”［3］。圈養(yǎng)條件下，動(dòng)物長(zhǎng)時(shí)間臥息或者站立觀望可以認(rèn)為是動(dòng)物的一種“規(guī)癖”或者“呆板”行為。有學(xué)者認(rèn)為，規(guī)癖行為的出現(xiàn)是由于對(duì)生產(chǎn)性狀的過(guò)度選育而造成的［24-25］，也有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)規(guī)癖是由于動(dòng)物在圈養(yǎng)條件下，其生存環(huán)境單調(diào)狹小造成的［26］。Grandin在20世紀(jì)70年代沒(méi)有發(fā)現(xiàn)牛卷舌和其它異常行為，而在1996年發(fā)現(xiàn)Holstein品種表現(xiàn)為卷舌規(guī)癖，這可能是長(zhǎng)期定向選擇的結(jié)果，對(duì)高產(chǎn)母豬(產(chǎn)仔數(shù)高)的研究也發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)較多的行為規(guī)癖［27］。對(duì)動(dòng)物園動(dòng)物研究表明，動(dòng)物園中馴養(yǎng)的靈長(zhǎng)類動(dòng)物因飼養(yǎng)環(huán)境單調(diào)狹小帶來(lái)的緊張對(duì)其健康不利［28］，導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)無(wú)目的踱步、咬柵欄、搖擺身體、空嚼等呆板行為。有報(bào)道指出對(duì)小鼠進(jìn)行應(yīng)激刺激后可導(dǎo)致OPRK1基因的mRNA差異表達(dá)［29］。梅花鹿圈養(yǎng)與外界的干擾也是一種應(yīng)激刺激，從而導(dǎo)致OPRK1基因外顯子表現(xiàn)多態(tài)性，并且這種多態(tài)性與觀望行為存在一定相關(guān)。另有研究表明，小鼠恐懼及焦慮行為同樣可影響Kappa阿片受體在腦杏仁核的表達(dá)狀況［30］。梅花鹿恐懼與焦慮的表現(xiàn)之一就是增加觀望時(shí)間，這種觀望行為的增加，也是其自身進(jìn)化和環(huán)境適應(yīng)相互作用的結(jié)果，表現(xiàn)在分子水平上，就有可能導(dǎo)致某些行為相關(guān)基因的突變，從而在OPRK1基因檢測(cè)獲得多態(tài)位點(diǎn)。

因此，在梅花鹿馴化飼養(yǎng)過(guò)程中，由于選擇選配或者飼養(yǎng)環(huán)境單調(diào)狹小或外界干擾刺激過(guò)多，可能增加其長(zhǎng)時(shí)間站立觀望行為。在適應(yīng)環(huán)境或干擾后又導(dǎo)致其臥息行為顯著升高，根據(jù)本研究對(duì)OPRK1基因不同基因型與行為性狀的相關(guān)分析結(jié)果，推測(cè)OPRK1基因可能在育種或者飼養(yǎng)過(guò)程中受到一定的選擇壓力，影響其行為規(guī)癖發(fā)育的傾向性，從而某種程度上可能形成“規(guī)癖”或者“呆板”行為。

［1］ Robinson G E，F(xiàn)ernald R D，Clayton D F.Genes and social behavior.Science，2008，322(5903):896-900.

［2］ Donaldson Z R，Young L J.Oxytocin，vasopressin，and the neurogenetics of sociality.Science，2008，322(2903):900-904.

［3］ Li J H，Cui W G，Wang Y，Bao J.Single nucleotide polymorphism in exon partial sequence of sow kappa opioid receptor gene.Acta Genetica Sinica，2004，31(12):1369-1374.

［4］ Saito M，Ehringer M A，Toth R，Oros M，Szakall I，Sikela J M，Vadasz C.Variants of K-opioid receptor gene and mRNA in alcohol-preferring and alcohol-avoiding mice.Alcohol，2003，29(1):39-49.

［5］ Gilbert P E，Martin W R.The effects of morphine and nalorphine-like drugs in the nondependent，morphine-dependent and cyclazocine-dependent chronic spinal dog.The Journal of Pharmacology Experimental Therapeutics，1976，198(1):66-82.

［6］ Evans C J，Keith D E Jr，Morrison H，Magendzo K，Edwards R H.Cloning of a delta opioid receptor by functional expression.Science，1992，258(5090):1952-1955.

［7］ Meng A M，Liu J S.The progress on the opioid receptor function.Chinese Journal of Neuroimmunlolgy and Neurology，2002，9(3):180-182.

［8］ Chen Y，Mestek A，Liu J，Hurley J A，Yu L.Molecular cloning and functional expression of a mu-opioid receptor from rat brain.Molecular Pharmacology，1993，44(1):8-12.

［9］ Mansour A，F(xiàn)ox C A，Burke S，Meng F，Thompson R C，Akil H，Watson S J.Mu，delta，and kappa opioid receptor mRNA expression in the rat CNS:an in situ hybridization study.The Journal of Comparative Neurology，1994，350(3):412-438.

［10］ Wittert G，Hope P，Pyle D.Tissue distribution of opioid receptor gene expression in the rat.Biochemical and Biophysical Research Communications，1996，218(3):877-881.

［11］ Guo Y S，Zheng H Z.On the geological distribution，taxonomic status of species and evolutionary history of Sika Deer in China.Acta Theriologica Sinica，2000，20(3):168-179.

［12］ Xu H F，Lu H J，Sheng H L，Gu C M.Status and current distribution of South China Sika Deer.Chinese Biodiversity，1998，6(2):87-91.

［13］ Sheng H L，Cao K Q，Li W J.Cervus Nippon，the Deer in China.Shanghai:East China Normal University Press，1992:8-18.

［14］ Liu H，Shi H Y，Hu J C.Daily activity rhythm and time budget of Sichuan Sika Deer(Cervus nippon sichuanicus)in spring.Acta Theriologica Sinica，2004，24(14):282-285.

［15］ Guo Y S，Zheng H Z.Life table and the rate of natural increase in Sichuan Sika Deer.Acta Theriologica Sinica，2005，25(2):150-155.

［16］ Lu X P，Wei F W，Li M，Yang G，Liu H.The relationship between Chinese Sika Deer(Cervus Nippon)genetic diversity and Japan deer.Chinese Science Bulletin，2006，51(3):292-298.

［17］ Whittington C J，Chamove A S.Effects of visual cover on farmed red deer behaviour.Applied Animal Behaviour Science，1995，45(3/4):309-314.

［18］ Lu S J，Todd P A，Yang Y，Liu Y Q，F(xiàn)an H M，Wei W H.The effects of visitor density on Sika Deer(Cervus nippon)behaviour in Zhu-Yu-Wan Park，China.Animal Welfare，2010，19(1):61-65.

［19］ Thévenon S，Thuy L T，Ly L V，Maudet F，Bonnet A，Jarne P，Maillard J C.Microsatellite analysis of genetic diversity of the vietnamese Sika deer(Cervus nippon pseudaxis).Journal of Heredity，2004，95(1):11-18.

［20］ Tamate H B，Okada A，Minami M，Ohnishi N，Higuchi H，Takatsuki S.Genetic variations revealed by microsatellite markers in a small population of the Sika Deer(Cervus nippon)on Kinkazan Island，Northern Japan.Zoological Science，2000，17(1):47-53.

［21］ Wang J N，Zhang D C.Research on the opioid receptor gene knock out mice.Chinese Clinical Neuroscience，2003，11(2):185-187.

［22］ Zhang R M，F(xiàn)eng Z T，Zhang L Q.Clinical and Treatment of Opiates Such As Heroin Dependence.Taiyuan:Shanxi Science and Technology Press，1999:28-46.

［23］ Lu S J，Yang Y，Wei W H.The association of BDNF gene polymorphisms with normal behavior traits in house-hold Sika Deer(Cervus nippon).Acta Ecologica Sinica，2011，31(17):4881-4888.

［24］ Wright S.The relationship of livestock breeding to theories of evolution.Journal of Animal Science，1978，46(5):1192-1200.

［25］ Belyaev D K.Destabilizing selection as a factor in domestication.Journal of Heredity，1998，70(5):301-308.

［26］ Grandin T.Genetics and the Behavior of Domestic Animals.San Diego:Academy Press，1997:319-343.

［27］ Von Borell E，Hurnik J F.The effect of haloperidol on the performance of stereotyped behavior in sows.Life Sciences，1991，49(4):309-314.

［28］ Carlstead K，Shepherdson D.Effects of environmental enrichment on reproduction.Zoo Biology，1994，13(5):447-458.

［29］ Lucas L R，Dragisic T，Duwaerts C C，Swiatkowski M，Suzuki H.Effects of recovery from immobilization stress on striatal preprodynorphin-and kappa opioid receptor-mRNA levels of the male rat.Physiology and Behavior，2011，104(5):972-980.

［30］ Knoll A T，Muschamp J W，Sillivan S E，F(xiàn)erguson D，Dietz D M，Meloni E G，Carroll F I，Nestler E J，Konradi C，Carlezon W A Jr.Kappa opioid receptor signaling in the basolateral amygdala regulates conditioned fear and anxiety in rats.Biological Psychiatry，2011，70(5):425-433.

參考文獻(xiàn):

［3］ 李劍虹，崔衛(wèi)國(guó)，王宇，包軍.豬Kappa阿片受體基因外顯子部分序列單核苷酸多態(tài)性分析.遺傳學(xué)報(bào)，2004，31(12):1369-1374.

［7］ 孟愛(ài)民，劉景生.阿片受體功能研究進(jìn)展(綜述).中國(guó)神經(jīng)免疫學(xué)和神經(jīng)病學(xué)雜志，2002，9(3):180-182.

［11］ 郭延蜀，鄭惠珍.中國(guó)梅花鹿地史分布、種和亞種的劃分及演化歷史.獸類學(xué)報(bào)，2000，20(3):168-179.

［12］ 徐宏發(fā)，陸厚基，盛和林，顧長(zhǎng)明.華南梅花鹿的分布和現(xiàn)狀.生物多樣性，1998，6(2):87-91.

［13］ 盛和林，曹克清，李文軍.中國(guó)鹿類動(dòng)物.上海:華東師范大學(xué)出版社，1992:8-18.

［14］ 劉昊，石紅艷，胡錦矗.四川梅花鹿春季晝夜活動(dòng)節(jié)律與時(shí)間分配.獸類學(xué)報(bào)，2004，24(14):282-285.

［15］ 郭延蜀，鄭慧珍.四川梅花鹿生命表和種群增長(zhǎng)率的研究.獸類學(xué)報(bào)，2005，25(2):150-155.

［16］ 呂曉平，魏輔文，李明，楊光，劉海.中國(guó)梅花鹿(Cervus nippon)遺傳多樣性及與日本梅花鹿間的系統(tǒng)關(guān)系.科學(xué)通報(bào)，2006，51(3):292-298.

［21］ 王佳楠，張德昌.阿片受體基因敲除小鼠的研究.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué)，2003，11(2):185-187.

［23］ 呂慎金，楊燕，魏萬(wàn)紅.圈養(yǎng)梅花鹿BDNF基因多態(tài)性與日常行為性狀的關(guān)聯(lián)分析.生態(tài)學(xué)報(bào)，2011，31(17):4881-4888.