黃 珂 陳艷紅

近年來(lái)，在兒童腫瘤中應(yīng)用以細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷(cytokine-induced killer，CIK) 細(xì)胞輸注為主導(dǎo)的細(xì)胞過(guò)繼免疫治療已經(jīng)逐漸受到重視。與CIK細(xì)胞殺傷激活關(guān)系密切的細(xì)胞間黏附分子-1( intercellularadhesionmolecule-1，ICAM-1，CD54)的研究越來(lái)越得到關(guān)注。腫瘤細(xì)胞表達(dá)的 ICAM-1與 CIK 細(xì)胞上表達(dá)的淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1(lymphocyte function associated antigen-1，LFA-1) 相互作用是 CIK 細(xì)胞殺傷、識(shí)別腫瘤細(xì)胞的主要機(jī)制。本研究擬檢測(cè)兒童腫瘤細(xì)胞 ICAM-1 表達(dá)水平并分析其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選擇我院2008年1月1日-2012 年12 月31日收治的兒童腫瘤患者共85例，分為實(shí)體瘤和非實(shí)體瘤(白血病)。實(shí)體瘤35例，其中淋巴瘤10 例，肝母細(xì)胞瘤2例，神經(jīng)母細(xì)胞瘤4例，橫紋肌肉瘤2 例，尤文氏肉瘤4例，原始神經(jīng)胚層腫瘤4 例，腎母細(xì)胞瘤9 例。非實(shí)體瘤指急性白血病(acute leukemia，AL)50例，包括急性淋巴細(xì)胞白血病(acutelymphocytic leukemia，ALL) 20 例和急性髓系白血病(acute myelocytic leukemia，AML) 30 例。AML中部分分化性粒細(xì)胞性白血病(M1)、分化性粒細(xì)胞性白血病(M2)、早幼粒細(xì)胞性白血病(M3) 型共 18 例，粒單細(xì)胞性白血病(M4)、單核細(xì)胞性白血病(M5)型共12 例。所有患兒均進(jìn)行骨髓象形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)、細(xì)胞免疫分型檢測(cè)和確診。選取健康移植供者骨髓20 例作為對(duì)照組。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測(cè)方法 ①實(shí)體瘤：手術(shù)切取患兒腫瘤實(shí)體組織制取的石蠟切片，采用免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)切片組織的 ICAM-1 表達(dá)水平。組織切片常規(guī)二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，放入新配制的 3% 過(guò)氧化氫甲醇 37℃孵育10 min，阻斷滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，蒸餾水洗 3 次。微波修復(fù)抗原，滴加血清封閉液 20 min。滴加 ICAM-1 一抗4℃冰箱孵育 60 min，用 PBS 沖洗3～5 min，滴加生物素標(biāo)志的 IgG 二抗37℃孵育20 min，滴加SABC(鏈霉卵白素+ 辣根酶標(biāo)記生物素) 20 min，DAB染色液 10 min顯色，蘇木精染色液染色 5 min，常規(guī)進(jìn)行脫水、透明、干燥、封片。②白血病：取流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)專(zhuān)用試管 1 支，加入多甲藻黃素-葉綠素-蛋白質(zhì)復(fù)合物(Percp)標(biāo)記的 CD45 單克隆抗體10 μl/孔，再加入藻紅蛋白(PE )標(biāo)記 ICAM-1 單克隆抗體10 μl/孔，加入 EDTA-K2抗凝的骨髓 50 μl/孔，低速渦流混勻，37℃避光反應(yīng) 20 min。加入BD FACS lysing solution溶血素 1 ml，混勻，37℃避光保存10 min。37℃條件下取180 g 離心 5 min，棄上清液，再加入 PBS 2 ml，均勻混合后取180 g 離心 5 min，棄去上清液。加入 1% 多聚甲醛 0.5 ml，均勻混合，在1～4 ℃ 保存，待檢測(cè)。FACSCalibur 流式細(xì)胞儀的開(kāi)機(jī)、關(guān)機(jī)等操作嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。開(kāi)機(jī)后啟動(dòng) FACSComp 軟件，標(biāo)準(zhǔn)熒光微球(calibration beads)校正儀器后，以 CellQuest Pro數(shù)據(jù)獲取分析軟件獲取數(shù)據(jù)。每管檢測(cè)10 000 個(gè)細(xì)胞，采用 CD45 / SSC 設(shè)門(mén)，分析白血病細(xì)胞群中 ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)水平。③對(duì)照組：分別取正常骨髓淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞及單核細(xì)胞檢測(cè)的 ICAM-1 表達(dá)水平。

1.2.2 判斷標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)顯微鏡下觀察到的棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行判斷，陰性(-):未觀察到棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞；出現(xiàn)棕黃色陽(yáng)性細(xì)胞本研究均定義為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。ICAM-1(CD54)表達(dá)采用百分?jǐn)?shù)表示，應(yīng)用描述性統(tǒng)計(jì)方法分析。患兒和正常兒童血液中ICAM-1(CD54)表達(dá)水平的比較采用列聯(lián)表資料χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ICAM-1(CD54)在患兒腫瘤組織中的表達(dá)

肝母細(xì)胞瘤ICAM-1檢出100.0%(2/2)，其他檢出ICAM-1的腫瘤有淋巴瘤、橫紋肌肉瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、尤文氏肉瘤，而腎母細(xì)胞瘤和原始神經(jīng)外胚層腫瘤未檢出ICAM-1。急性淋巴細(xì)胞白血病和急性髓系白血病檢出率分別為50.0%(10/20)和53.3%(16/30)。見(jiàn)表1。

表1 兒童腫瘤組織中ICAM-1(CD54)的表達(dá)水平

2.2 白血病患兒和正常兒童ICAM-1表達(dá)的比較

ALL 患兒骨髓細(xì)胞的 ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)率為50.0%(10/20)，與對(duì)照組骨髓中淋巴細(xì)胞上 ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)率(65.0%)比較無(wú)顯著差異，χ2=0.921，P=0.337。AML ( M1、M2 和 M3) 患兒骨髓細(xì)胞的 ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)率為66.7% (12/18)，顯著高于對(duì)照組骨髓中粒細(xì)胞上 ICAM-1 的陽(yáng)性表達(dá)率(10.0%)(χ2=15.292，P=0.000);AML ( M4、M5) 患兒骨髓細(xì)胞的 ICAM-1 陽(yáng)性表達(dá)率為 33.3%(4/12)，顯著低于正常對(duì)照組骨髓中單核細(xì)胞上 ICAM-1 的陽(yáng)性表達(dá)率(75.0%)(χ2=5.398，P=0.020)。

3 討論

細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)屬細(xì)胞黏附分子免疫球蛋白超家族[1]，是重要的炎性細(xì)胞因子，在炎癥發(fā)生與發(fā)展中起著重要作用。當(dāng)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞受侵襲時(shí)其表面的ICAM-1經(jīng)活化后可與白細(xì)胞表面的αLβ2及巨噬細(xì)胞表面的αMβ2相結(jié)合，使白細(xì)胞固著于炎癥部位的脈管內(nèi)皮，進(jìn)而分泌水解酶而穿出脈管壁，促使病變的擴(kuò)散。目前ICAM-1在腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移及機(jī)體抗免疫功能對(duì)抗腫瘤的作用中已引起相關(guān)領(lǐng)域的廣泛重視。研究認(rèn)為，兒童白血病患者中ICAM-1表達(dá)發(fā)生異常改變，與白血病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后情況有密切聯(lián)系。ICAM-1的表達(dá)異常通過(guò)細(xì)胞毒性T細(xì)胞、NK殺傷細(xì)胞作用，ICAM-1依賴的主要組織相容性復(fù)合體類(lèi)抗原免疫識(shí)別的影響而發(fā)揮作用。

機(jī)體在抗腫瘤免疫中起主要作用的是細(xì)胞免疫，ICAM-1與其配體抗淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1( LFA-1) 結(jié)合后，主要通過(guò)激活 T 細(xì)胞、促使B淋巴細(xì)胞的分化、增強(qiáng)CIK細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。CIK 細(xì)胞能同時(shí)表達(dá)CD3+和CD56+膜蛋白分子，具有T淋巴細(xì)胞強(qiáng)大的抗瘤活性和NK細(xì)胞的非MHC限制性殺瘤特點(diǎn)，殺傷活性可以達(dá)到 84.7%，比NK、LAK 細(xì)胞抗腫瘤作用更強(qiáng)[2]。CIK細(xì)胞作用機(jī)理是通過(guò)不同的機(jī)制識(shí)別腫瘤細(xì)胞，釋放顆粒酶/穿孔素等毒性顆粒，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞裂解[3]。CIK細(xì)胞在培養(yǎng)過(guò)程中表達(dá)FasL(Ⅱ型跨膜糖蛋白)，通過(guò)與腫瘤細(xì)胞膜表達(dá)的Fas(Ⅰ型跨膜糖蛋白)結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。體外培養(yǎng)的CIK細(xì)胞可以分泌多種細(xì)胞因子，如IFN-γ、TNF-α、IL-2等，不僅對(duì)腫瘤細(xì)胞有直接抑制作用，還可通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)反應(yīng)性間接殺傷腫瘤細(xì)胞[4]。

腫瘤細(xì)胞上 ICAM-1 表達(dá)數(shù)量決定了其對(duì)CIK 細(xì)胞的殺傷是否敏感。本次研究顯示，ICAM-1 在AML 骨髓細(xì)胞上的表達(dá)與對(duì)照組比較差異明顯;在 M1、M2和 M3 型AML 骨髓細(xì)胞上表達(dá)高于對(duì)照組，而 M4 和 M5 型 AML 骨髓細(xì)胞上表達(dá)顯著低于對(duì)照組。這與熊稀霖等[2]的研究結(jié)果基本一致，M1、M2和 M3 型AML對(duì)CIK細(xì)胞抗腫瘤作用效果明顯。國(guó)外研究認(rèn)為，CIK 細(xì)胞的細(xì)胞毒活性可被抗 LFA-1 或 ICAM-1 的單克隆抗體所阻滯，這進(jìn)一步提示細(xì)胞表面黏附分子ICAM-1在 CIK 細(xì)胞識(shí)別腫瘤過(guò)程中起關(guān)鍵作用[2]。

也有研究顯示[5]，ICAM-1與LFA-1和Mac-1結(jié)合可以抑制細(xì)胞毒性T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞的激活與信號(hào)的傳遞，使細(xì)胞毒性T細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞的活性降低，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體的細(xì)胞免疫監(jiān)視。同時(shí)，ICAM-1過(guò)度活化可產(chǎn)生大量的sICAM-1進(jìn)入血液，通過(guò)對(duì)ICAM-1依賴的主要組織相容性復(fù)合體類(lèi)抗原免疫識(shí)別競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用，使腫瘤細(xì)胞躲避機(jī)體的免疫監(jiān)視，發(fā)生腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。表達(dá) ICAM-1 的腫瘤細(xì)胞與淋巴細(xì)胞的黏附性增強(qiáng)，隨著淋巴細(xì)胞移動(dòng)，引起腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移。研究發(fā)現(xiàn)[6-7]，大腸癌、肺癌細(xì)胞表面ICAM-l的過(guò)度表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胃癌細(xì)胞表面高表達(dá)ICAM-1分子，其產(chǎn)生的sICAM-l可促進(jìn)癌細(xì)胞的血源性轉(zhuǎn)移。

總之，兒童腫瘤細(xì)胞ICAM-1分子的表達(dá)與CIK細(xì)胞免疫殺傷腫瘤細(xì)胞有關(guān)，高表達(dá) ICAM-1分子的腫瘤細(xì)胞易受到CIK 細(xì)胞抗腫瘤作用。患兒腫瘤細(xì)胞ICAM-1分子高表達(dá)也可能發(fā)生腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。參考兒童腫瘤ICAM-1的水平，可對(duì)病情進(jìn)行合理地判斷，選擇適宜的免疫治療方案。高表達(dá)ICAM-1的腫瘤患兒應(yīng)考慮積極使用 CIK 細(xì)胞免疫治療[8]。

[1] 張 潔,陳俊杰,陳成水,等.STAT1和ICAM-1在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其臨床意義〔J〕.中國(guó)病理生理雜志,2012,28(8):1378.

[2] 熊稀霖,黎 陽(yáng),王 林,等.兒童腫瘤及急性白血病中 ICAM-1(CD54)的表達(dá)及在CIK 細(xì)胞免疫治療中的臨床意義〔J〕.中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志,2012,20(2):282.

[3] Introna M，Pievani A，Borleri G，et al． Feasibility and safety of adoptive immunotherapy with CIK cells after cord blood transplantation〔J〕.Biol Blood Marrow Transplant，2010,16 (11):1603.

[4] Helms MW，Prescher JA，Cao YA，et al. IL-12 enhances efficacy and shortens enrichment time in cytokine-induced killer cell immunotherapy〔J〕.Cancer Immunol Immunother，2010,59 (9):1325.

[5] Li H,Ge C,Zhao F,et al.Hypoxia-inducible factor-1 alpha-activated angiopoiet n-like protein 4 contributes to tumor metastasis via vascular cell adhesion molecule-1/integrin β1 signaling in human hepatocellular caicinoma〔J〕.Hepatology,2011,4(3):910.

[6] Hayes SH,Seigel GM.Immunoreactivity of ICAM-1 in human tumors,metastases and nomal tussues〔J〕.Int J Clin Exp Pathol,2009,2(6):553.

[7] 宋蘭英,閆文生,張進(jìn)華,等.黏附分子CD54、CD44V6在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用〔J〕.實(shí)用癌癥雜志,2003,18(1):54.

[8] Linn YC，Niam M，Chu S，et al． The anti-tumour activity of allogeneic cytokine-induced killer cells in patients who relapse after allogeneic transplant for haematological malignancies〔J〕.Bone Marrow Transplant，2012，47(7):957.