許俊龍 張 杰 李玉紅 賈愛華

腫瘤細胞的浸潤和轉(zhuǎn)移是影響患者生存和預后的重要因素[1]。樁蛋白( Paxillin)是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一能與癌基因結合的含酪氨酸的黏附調(diào)節(jié)蛋白,已發(fā)現(xiàn)其在腫瘤細胞的粘附和遷移過程中起著非常重要的作用，與腫瘤的轉(zhuǎn)移關系密切。上皮性惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移首先要通過侵入淋巴管，隨淋巴流到達局部淋巴結,而D2-40是比較特異的淋巴管內(nèi)皮細胞的標記物[2]。目前，國內(nèi)外有關Paxillin、D2-40與早期胃癌的相關研究甚少，本研究運用免疫組化Elivisionplus法檢測Paxillin和D2-40在早期胃癌和正常胃黏膜組織中的表達，以探討兩者的表達與早期胃癌各臨床指標間的關系以及兩者在早期胃癌組織中表達的相關性，判斷其在早期胃癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集聊城市人民醫(yī)院病理科2002年1月～2012年3月早期胃癌76例蠟塊，所有的病例都做了胃癌根治術，術前未接受放、化療，其中男性60例，女性16例，年齡33～83歲，平均年齡61.6歲；乳頭狀腺癌及分化好的冠、管狀腺癌36例，分化差者40例；局限于黏膜層者26例，侵及黏膜肌層者14例，侵及黏膜下層者36例；其中胃漿膜外淋巴結轉(zhuǎn)移者8例。所有病例均進行全部胃黏膜取材，用癌周圍基本正常的胃黏膜組織作為對照。全部標本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林液固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟,高溫高壓熱抗原修復,嚴格按照免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(福建邁新生物技術開發(fā)有限公司)操作步驟進行免疫組化染色。

1.2 試劑與方法

即用型鼠抗人Paxillin單克隆抗體和即用型D2-40單克隆抗體均購自福州邁新試劑公司。采用免疫組化ElivisionTMplus法。實驗步驟按說明書進行。用已知陽性片作陽性對照;用PBS 液代替一抗作陰性對照。

1.3 結果判斷

采用雙盲法，由2位病理醫(yī)師獨立觀察每張切片5 個具有代表性的高倍視野，在組織切片中胞質(zhì)染為淡黃色至棕褐色為陽性細胞標志，根據(jù)腫瘤細胞質(zhì)或核的染色程度及染色細胞百分率進行分析評分：基本不著色為0分，著色淡黃為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；著色細胞占計數(shù)細胞百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分，將每張切片著色程度得分與著色細胞百分率得分各自相乘為其最后得分，0～1 分為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～6 分為中等陽性(++)，6分以上為強陽性(+++)。

Paxillin主要表達于癌細胞胞質(zhì)中，觀察5個視野,每個視野計數(shù)200個細胞,共計1000個,以細胞無棕黃色或與背景一致的淺棕黃色為陰性細胞,細胞中出現(xiàn)明顯棕黃色顆粒為陽性細胞，計算每張切片陽性細胞百分率。D2-40陽性表達定位于淋巴管內(nèi)皮細胞膜和胞質(zhì),呈棕黃色。LMVD結果的判定參考Weidner的方法[3]。根據(jù)D2-40染色以陽性著色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇分別計為1個陽性微淋巴(LMVD )。先在40倍光學顯微鏡下確定5個著色密集的區(qū)域(即“hotspot”),200倍光學顯微鏡下分別計數(shù)5個視野,取其均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

Paxillin、D2-40在正常胃黏膜組織和早期胃癌中表達的差異及與臨床病理因素的關系采用χ2檢驗,Paxillion、D2-40表達的相關性分析采用Spearman等級相關分析法,P<0.05及P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義(應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件)。

2 結果

2.1 胃組織中Paxillin的表達及LMVD

根據(jù)Speiser的判定標準:切片中陽性細胞數(shù)小于10% 為陰性片,大于10%為陽性片。Paxillion在76例早期胃癌和相應正常胃黏膜中的陽性表達率分別為71.1%(54/76)和9.2%(7/76)。早期胃癌和相應正常胃黏膜組織的LMVD的表達情況，見表1。

表1 早期胃癌和正常胃黏膜的Paxillin的表達及其LMVD比較

2.2 早期胃癌中D2-40標記的LMVD的特點

正常胃黏膜組織中D2-40 陽性染色微淋巴管在黏膜固有層、黏膜下層、肌層及漿膜層均可見到,在黏膜下層數(shù)目最多,多呈擴張狀,形態(tài)大小不一,壁較薄,其LMVD為(3.2±1.8)個/mm2；早期胃癌組織中也可見明顯的D2-40陽性染色微淋巴管,管內(nèi)未見RBC,少數(shù)微淋巴管內(nèi)可見淋巴細胞,有淋巴結轉(zhuǎn)移的早期癌中可在微淋巴管內(nèi)發(fā)現(xiàn)癌栓,甚至在部分淋巴結無轉(zhuǎn)移的早期胃癌微淋巴管內(nèi)也發(fā)現(xiàn)癌栓。在早期胃癌組織中,腫瘤邊緣和中心均可見微淋巴管,但其分布和形態(tài)具有明顯的差異性。分布差異:腫瘤邊緣區(qū)微淋巴管數(shù)目少,其LMVD為(12.3 ±2.4)個/mm2,而腫瘤中心區(qū)微淋巴管數(shù)目多,其LMVD為(16.7±3.3)個/mm2(P<0.05)。據(jù)我們觀察腫瘤邊緣區(qū)和中心區(qū)微淋巴管均為管腔較大,為中空橢圓形呈擴張的功能淋巴管,兩者之間形態(tài)未見明顯差異。Paxillin蛋白的陽性表達及D2-40染色所顯示LMVD在早期胃癌和相較于表達陰性者呈明顯增高現(xiàn)象(P<0.01),見表2。

表2 早期胃癌中Paxillion陽性表達與LMVD和臨床病理因素的關系比較(例，%)

2.3 早期胃癌Paxillin蛋白表達與D2-40標示的LMVD的關系

Paxillin蛋白陽性患者的LMVD值為(21.3±2.6)個/mm2，而Paxillin陰性的早期胃癌患者的LMVD值為(8.4±2.4)個/mm2，兩者比較有統(tǒng)計學意義(T=8.4627,P<0.05)。

3 討論

研究證明惡性腫瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移是其生物學本性之一，而腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有著非常復雜的病理生理學因素，多種因素參與其中，正常組織細胞、腫瘤細胞和基質(zhì)之間的粘附和脈管因素對其有重要影響[4,5]。通常認為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移先是由于腫瘤細胞與基膜粘附性降低，進而脫離基膜,在間質(zhì)中形成浸潤灶,再以粘附、溶解結締組織的方式穿破進入血液或淋巴,隨血液或淋巴到達其他組織器官并再突破脈管基膜,在局部增殖形成轉(zhuǎn)移灶,因此腫瘤細胞粘附性的強弱和腫瘤間質(zhì)脈管的形成及其密度在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中起關鍵作用[6]。

Paxillin是近年來發(fā)現(xiàn)的1種重要的細胞黏附因子,主要存在于黏著斑,而黏著斑是細胞與細胞外基質(zhì)(ECM) 聯(lián)系的紐帶,可促進信號從ECM 經(jīng)整合素途徑向細胞內(nèi)傳遞。Paxillin還是致瘤性酪氨酸激酶的1種底物,與整合素相關聯(lián),構成細胞與細胞外基質(zhì)局部黏附關鍵部位,調(diào)節(jié)細胞的移動和播散等功能,從而提高腫瘤細胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力[7,8]。本實驗通過對Paxillin在早期胃癌和相應正常胃黏膜中的表達進行比較，發(fā)現(xiàn)早期胃癌的Paxillin病例陽性表達高于正常胃黏膜的陽性表達，兩者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01),提示早期胃癌中Paxillin蛋白高表達有實際意義,目前還沒有合適的生物學指標可以準確地預測早期胃癌的發(fā)展和預后。Paxillin在早期胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中起重要作用,有可能成為判斷早期胃癌生物學行為的重要指標。

在大多數(shù)實體腫瘤中,癌細胞通過淋巴管向局部淋巴結擴散是轉(zhuǎn)移性疾病中1個重要的早期事件。腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移需要新脈管生成,腫瘤微脈管形成在許多臨床腫瘤中已被證實是1個判斷轉(zhuǎn)移、預測預后的新指標?，F(xiàn)在用于反映LMVD 的標記物有多種,其中D2-40特異性最強[9]。目前以D2-40為標記來研究早期胃癌的LMVD 的報道尚不多見。本實驗以D2-40 標記正常胃組織及早期胃癌組織中的LMVD,結果表明,早期胃癌中心區(qū)和周邊區(qū)均見明顯增多的淋巴管，而且管腔擴張的有功能的淋巴管和管腔閉鎖的無功能的淋巴管未見有明顯區(qū)別，這種結果與孫薇等[10]的研究結果相沖突。本實驗還發(fā)現(xiàn)：早期胃癌組織中LMVD 明顯高于正常胃組織,有胃漿膜外淋巴結轉(zhuǎn)移者LMVD 明顯高于無轉(zhuǎn)移者 (P均<0.05)，這提示淋巴管的生成與腫瘤淋巴結轉(zhuǎn)移密切相關。通過淋巴管轉(zhuǎn)移至引流區(qū)淋巴結可能是一些腫瘤初始轉(zhuǎn)移階段最主要的途徑,癌細胞以“離散”方式存在于淋巴管內(nèi),能動性增加,侵襲性增強,易于突破基膜,向周圍組織浸潤,并穿過淋巴管,發(fā)生淋巴結轉(zhuǎn)移。提示高LMVD可能是早期胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的結構基礎，通過D2-40檢測的LMVD可以作為預測早期胃癌患者淋巴轉(zhuǎn)移風險的指標。

總之，Paxillin和D2-40在早期胃癌中高表達，而且腫瘤組織分化越低，Paxillin表達越強，D2-40標記的淋巴管生成量越多，從而可以推測淋巴結越有轉(zhuǎn)移的可能，雖然不能說明二者有直接關系，但可以推測Paxillin和D2-40可以成為預測早期胃癌轉(zhuǎn)移與預后的重要指標。

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