馬 玲

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是1種以廣泛轉(zhuǎn)移為特征的發(fā)生在卵巢上皮細(xì)胞、基質(zhì)及生殖細(xì)胞的惡性腫瘤,女性發(fā)病率約為1/70，且預(yù)后差。大部分卵巢癌患者發(fā)病早期無明顯的臨床表現(xiàn)，現(xiàn)在也無有效的篩查方法，所以大多數(shù)患者在診斷時已經(jīng)為腫瘤Ⅲ期或者Ⅳ期。在疾病晚期，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移不可避免，預(yù)后更差，長期存活率約為20%[1]。為了提高卵巢癌患者的生存率，尋找能夠獨立或者輔助傳統(tǒng)手術(shù)及化學(xué)藥物治療的新的途徑和治療方法勢在必行。

Toll樣受體(toll-like receptors，TLRs)是1種跨膜蛋白，可感應(yīng)入侵的病原微生物，主要存在于免疫細(xì)胞內(nèi)，如樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞[2]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)TLRs與腫瘤的進(jìn)展關(guān)系密切。已有證據(jù)證明腫瘤細(xì)胞可以利用TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程來利于自身的生長。TLR配體可通過刺激炎癥因子，尤其是NF-kB的活性來促進(jìn)腫瘤的生長[3]。尤其是對于卵巢腫瘤，Zhou等發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR3、TLR4及TLR5均在正常卵巢上皮及新生卵巢上皮細(xì)胞腫瘤中呈高表達(dá)[4]。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，TLR4在卵巢顆粒細(xì)胞腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增強[5]。本研究通過檢測卵巢癌組織中TLR4表達(dá)，同時分析TLR4表達(dá)與卵巢癌臨床特征的關(guān)系，以探討TLR4表達(dá)的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的收集

2010年3月至2012年3月，我院婦科收治卵巢癌患者40例，平均年齡(43.8±7.7)歲。均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實，其中漿液性囊腺癌16例，黏液性囊腺癌12例，子宮內(nèi)膜樣腺癌9例，透明細(xì)胞癌1例，未分化癌2例。采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)2000年臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，Ⅰ期5例，Ⅱ期10例，Ⅲ期19例，Ⅳ期6例。組織分化程度：高分化10例，中分化13例，低分化17例。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移22例。術(shù)前均未接受放、化療或者激素治療。

手術(shù)切除后，立即采集卵巢癌組織及相應(yīng)的癌旁組織(距腫瘤邊緣2～3 cm)，立即放入液氮中，-80℃保存。以30例正常卵巢組織標(biāo)本作為對照，取自同期因子宮或者卵巢良性病變而行手術(shù)者，并經(jīng)術(shù)后病理檢查證實為正常卵巢組織，患者年齡為(45.6±6.7)歲。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆抗體TLR4購自Sigma公司，Western blot試劑盒購自Pierce公司，蛋白質(zhì)定量試劑盒、組織蛋白抽提試劑盒購自上海康成公司，Trizol試劑購自Invitrogen life technology，RNA引物由上海英俊公司合成。

1.3 主要儀器

2720型PCR擴增儀為AB公司產(chǎn)品，J2-MC離心機為Beckman公司產(chǎn)品，721分光度計由上海分析儀器廠生產(chǎn)，Western blot實驗設(shè)備均為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.4 RT-PCR檢測TLR4 mRNA的表達(dá)

采用Trizol試劑提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。取2 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物行PCR反應(yīng)。TLR4基因引物序列：上游引物為5’GGTCAGACGGTGATAGCGAG-3’，下游引物為5’GGTCCAGGTTCTTGGTTGAG3’，擴增產(chǎn)物長度為255 bp。反應(yīng)體系總體積為50 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s，58℃ 45 s，70℃ 1 min，28個循環(huán)。取10 μl反應(yīng)產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠電泳分離照相，以TLR4灰度積分與相應(yīng)β-actin灰度積分的比值作為TLR4相對表達(dá)強度，重復(fù)實驗3次。

1.5 Western blot方法檢測TLR4蛋白表達(dá)

取組織標(biāo)本，在緩沖液中勻漿，冰浴10 min，4℃、14 000 r/min，離心15 min。提取總蛋白進(jìn)行蛋白定量。取上清，水煮變性后，按照蛋白定量結(jié)果進(jìn)行加樣，經(jīng)12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉37℃封閉。PBS洗滌后，加入兔抗人TLR4抗體(1∶100)工作液，4℃過夜。充分洗滌后，加羊抗鼠二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。PBS漂洗后成像，分析檢測結(jié)果，以β-actin作為內(nèi)參照，計算吸光度(A)比值，重復(fù)實驗3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Western blot檢測結(jié)果

卵巢癌組織中TLR4表達(dá)量明顯高于相應(yīng)的癌旁組織及正常卵巢組織；灰度分析結(jié)果顯示，卵巢癌組織、癌旁組織和正常卵巢組織中其相對表達(dá)量分別為0.801±0.073、0.399±0.078和0.134±0.059，卵巢癌組織中TLR4表達(dá)量明顯高于相應(yīng)的癌旁組織及正常卵巢組織(P<0.05)。

2.2 RT-PCR檢測結(jié)果

實時定量PCR檢測TLR4 mRNA水平，結(jié)果與免疫組化及Western blot結(jié)果相一致，TLR4 mRNA表達(dá)量卵巢癌組織明顯高于癌旁組織和正常卵巢組織(0.0647±0.0253、0.0350±0.0220、0.0167±0.0136，P<0.05)。

2.3 TLR4表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系

40例卵巢癌組織中，TLR4蛋白表達(dá)與腫瘤分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與腫瘤大小、病理類型無關(guān)(P>0.05),見表1。

3 討論

TLR4是TLRs中的1個亞型，它是在哺乳動物中最早被發(fā)現(xiàn)的與果蠅Toll受體高度同源的TLR。TLR通過激活免疫細(xì)胞使機體產(chǎn)生內(nèi)源性或外源性免疫應(yīng)答。已有多種研究表明TLR4與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Adam等[6]研究表明TLR4在胃癌、肝細(xì)胞癌、前列腺癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，特別是TLR4的Asp299Gly基因多態(tài)性與腫瘤的發(fā)生發(fā)展高度相關(guān)。此外，TLR4在腫瘤細(xì)胞的凋亡過程中起重要作用。Cianchi等[7]發(fā)現(xiàn)TLR4通過抑制凋亡增強了腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。已有文獻(xiàn)報道在卵巢上皮癌組織及細(xì)胞系中，TLR4為陽性表達(dá)，為卵巢癌的治療提供新的治療靶點。

表1 TLR4表達(dá)與卵巢癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

近年來發(fā)現(xiàn)卵巢癌組織中有多種因子表達(dá),與腫瘤分期或者預(yù)后有關(guān)[8,9],本研究通過檢測卵巢癌組織中TLR4蛋白表達(dá)及mRNA水平，并且與癌旁組織及正常卵巢組織進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，在卵巢癌組織、癌旁組織及正常卵巢組織中均有TLR4蛋白表達(dá)，且以卵巢癌組織中表達(dá)水平最高，這與Adam對胃癌、肝細(xì)胞癌的研究結(jié)果一致。卵巢癌組織中TLR4蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小及病理類型無關(guān)，但與腫瘤分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及FIGO分期有關(guān)，提示TLR4參與卵巢癌組織的惡性遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移過程。

有研究發(fā)現(xiàn)，TLR4拮抗性配體白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以拮抗TLR4/MyD88信號通路介導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞IL-6的分泌，且可以選擇性增強紫杉醇對MyD88+卵巢癌細(xì)胞的生長抑制作用，為改善紫衫醇治療MyD88+卵巢癌提供1種新的思路和方法[10]。綜上所述，TLR4與卵巢癌細(xì)胞的惡性程度關(guān)系密切，激活的TLR4通路促進(jìn)了卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。

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