楊 娟 肖 蘭

P57KIP2蛋白是1種細胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)，屬CIP/KIP家族，在細胞周期中起負調(diào)控作用，能抑制細胞從 G1期到 S期的轉(zhuǎn)化，進而阻止細胞的增殖，被認為具有抑癌基因活性。而SKP2既S期激酶相關(guān)蛋白2，是SCF復合物的成員之一，能特異性識別底物并與之結(jié)合,使之進入泛素化蛋白酶體降解途徑。有關(guān)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中SKP2與P57KIP2表達的相關(guān)性，目前國內(nèi)外少有報道。我們采用免疫組化SP法，檢測P57KIP2、SKP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中的表達，比較其表達與卵巢黏液性腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，并探討卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中P57KIP2與SKP2表達的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

本組標本均取自孝感市中心醫(yī)院2009年1月～2012年1月手術(shù)切除的標本。卵巢黏液腺癌47例,年齡42～76歲，平均年齡61歲；卵巢黏液性交界性腫瘤12例(不包括交界性腫瘤伴微小浸潤)，均經(jīng)充分取材，未見黏液腺癌成分，年齡39～68歲，平均年齡56歲；卵巢良性黏液性囊腺瘤12例，經(jīng)充分取材，確認為良性，年齡40～58歲，平均年齡45歲。卵巢黏液腺癌：高分化11例，中分化26例，低分化10例；TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期共36例，Ⅲ期、Ⅳ期共11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例。

1.2 試劑

即用型單克隆抗體鼠抗人P57KIP2購自福州邁新公司,即用型單克隆抗體鼠抗人SKP2、通用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化SP法,具體步驟按說明書進行。以PBS液代替一抗作為陰性對照。P57KIP2陽性染色位于細胞核或細胞質(zhì)內(nèi),以細胞核染色為主；SKP2陽性染色位于細胞核內(nèi)，均為黃色或棕黃色顆粒，本組切片均無胞核與胞質(zhì)同時表達的現(xiàn)象。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機計數(shù)1000個腫瘤細胞,根據(jù)陽性細胞數(shù)占腫瘤細胞總數(shù)的百分比計分:①陽性細胞數(shù)<5%為陰性(-);②5%～24%為弱陽性(+);③ 25%～49%為陽性(++);④≥50%為強陽性(+++) 。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS11.0軟件，采用四格表資料的χ2檢驗、行×列資料的χ2檢驗(校正)及Pearson相關(guān)分析進行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1 P57KIP2、SKP2蛋白在卵巢各黏液性腫瘤組織中的表達情況

表1 P57KIP2、SKP2蛋白在卵巢各黏液性腫瘤組織中的表達情況(例)

a為良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤比較；b為黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌比較；c為良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌比較

由表1可見，卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌組織中P57KIP2陽性表達率分別為100.0%、91.7%、44.7%，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤其陽性表達率比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌、良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌比較均具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中SKP2陽性表達率分別為0、16.7%、36.2%，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤、黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，而良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌其陽性表達率比較具有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

2.2 P57KIP2、SKP2蛋白表達與卵巢黏液腺癌臨床病理特征的關(guān)系

P57KIP2、SKP2表達與卵巢黏液腺癌患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性(P> 0.05)，與卵巢黏液腺癌組織學分化及TNM分期相關(guān)(P< 0.05)，在高、中、低分化卵巢黏液腺癌中P57KIP2陽性表達率依次下降，而SKP2陽性表達率依次升高，見表2。

表2 P57KIP2、SKP2蛋白表達與卵巢黏液腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 P57KIP2、SKP2蛋白在胞質(zhì)中的表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

10例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，P57KIP2胞質(zhì)陽性表達4例，陽性率為40.0%(4/10)，37例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，P57KIP2胞質(zhì)陽性表達3例，陽性率為8.1%(3/37)，兩者比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中SKP2胞質(zhì)陽性表達1例，陽性率為10.0%(1/10)，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，其胞質(zhì)陽性表達6例，陽性率為16.2%(6/37)，兩者比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4 卵巢黏液腺癌組織中P57KIP2與SKP2表達的相關(guān)性

表3 卵巢黏液腺癌組織中P57KIP2與SKP2表達的相關(guān)性(細胞核表達)(例)

由表3可見，卵巢黏液腺癌中P57KIP2蛋白和SKP2蛋白同時陽性表達有4例(4/21),P57KIP2蛋白和SKP2蛋白同時陰性表達有13例(13/26) ，經(jīng)Pearson相關(guān)分析兩者呈負相關(guān)性(γ=-0.292,P=0.046<0.05)。

3 討論

研究表明P57KIP2蛋白通過與Cyclin-CDK復合物結(jié)合而抑制CDK活性，P57KIP2 蛋白主要抑制CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2等G1期和S期激酶復合物,使細胞不能通過 G1期[1]，從而抑制細胞的增殖 ，起到腫瘤抑制基因的效應。本研究結(jié)果顯示P57KIP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中陽性表達率依次降低，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤其陽性表達率比較無統(tǒng)計學差異，而兩者與黏液腺癌陽性表達率比較均有統(tǒng)計學差異。在黏液腺癌中，P57KIP2表達與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，其低表達與腫瘤分化低及TNM分期晚有關(guān)，另外，本研究結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌P57KIP2胞質(zhì)陽性表達率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義。有學者提出P27KIP1蛋白在胞質(zhì)中表達與CyclinD1和CyclinD3過表達顯著相關(guān),并發(fā)現(xiàn)P27KIP1突變后(CyclinD結(jié)合位點的丟失)，則在核中的表達增強[2]。由于P57KIP2與P27KIP1是密切相關(guān)的2種CDKI，同屬CIP/KIP家族，在結(jié)構(gòu)上也具有一定的同源性，因此推測在細胞惡變的過程中，細胞核中的CyclinD出現(xiàn)過表達，P57KIP2在細胞核中合成后與CyclinD-CDK4結(jié)合并被移致胞質(zhì)，導致胞質(zhì)中P57KIP2表達水平升高而胞核中P57KIP2表達水平下降。

本研究結(jié)果顯示，SKP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中陽性表達率依次升高，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤、黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌中SKP2陽性表達率比較無統(tǒng)計學差異，而良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌中其陽性表達率具有統(tǒng)計學差異，在黏液腺癌中SKP2表達與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)，而其高表達與腫瘤分化低及TNM分期晚有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌SKP2胞質(zhì)陽性表達率較無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義。這些結(jié)果表明了SKP2高表達與黏液腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。虞志強[3]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸癌中SKP2陽性表達率與脈管內(nèi)癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān),顯示SKP2在大腸癌中表達水平與組織分化程度和TNM分期有關(guān),在低分化大腸癌中呈高表達,且其表達水平在高、中、低分化癌組織中存在顯著性差異,說明SKP2蛋白過表達與大腸癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。這些結(jié)果都表明，SKP2在細胞分化過程中發(fā)揮重要作用,因此,SKP2可能作為判斷惡性腫瘤惡性程度的輔助指標。

P57KIP2和P27KIP1是2種密切相關(guān)的CDKI，同屬于CIP/KIP家族，兩者的N-末端有40%的同源性，而C-末端均有核觸發(fā)區(qū)域，其中含有磷酸化位點，P57KIP2的磷酸化位點是310位蘇氨酸,P27KIP1的磷酸化位點是187位蘇氨酸。cyclinE-CDK2促使P27KIP1的187位蘇氨酸磷酸化，磷酸化后的P27KIP1能被SKP2識別而進入泛素蛋白酶體途徑被降解[4]，本研究旨在探討磷酸化后的P57KIP2是否也能被SKP2識別而進入泛素蛋白酶體途徑被降解。本研究結(jié)果經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示P57KIP2表達與SKP2表達呈負相關(guān)，從而初步推測在卵巢粘液性腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中，SKP2參與了P57KIP2的降解，這與Kamura[5]的研究結(jié)果基本一致。目前有研究表明，SKP2是在G1期向S期轉(zhuǎn)換的過程中降解P57KIP2，而在G0/G1過度期也可以觀察到P57KIP2的降解，至于P57KIP2在G0/G1過度期的降解機制目前仍不清楚，需要進一步探討。

所以，在卵巢黏液腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中P57KIP2表達水平下降的原因推測如下：① 在卵巢組織惡變的過程中，細胞核中的cyclinE-CDK2復合物的活性增強，使P57KIP2磷酸化而被SKP2識別并進入泛素蛋白酶體途徑被降解；②在細胞惡變的過程中，細胞核中CyclinD出現(xiàn)過表達，P57KIP2在細胞核中合成后與CyclinD-CDK4結(jié)合并被移致胞質(zhì)，導致細胞核中P57KIP2的表達水平下降；③在卵巢組織惡變的過程中，P57KIP2基因組出現(xiàn)了基因印記缺失或印記錯誤導致了基因表達水平下降。細胞核中P57KIP2表達水平下降，使P57KIP2對CyclinE-CDK2 、CyclinA-CDK2的結(jié)合抑制作用及對PCNA的結(jié)合抑制作用減弱，從而減弱了對細胞周期的抑制作用，又進一步促進卵巢組織的惡變。

綜上所述,P57KIP2、SKP2的異常表達與卵巢黏液腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),P57KIP2抑制卵巢黏液腺癌的發(fā)生發(fā)展，而SKP2促進其發(fā)生發(fā)展。P57KIP2、SKP2蛋白的檢測可為判斷卵巢黏液腺癌的惡性程度提供重要參考。目前，國內(nèi)外關(guān)于SKP2與P27KIP1的相關(guān)性的研究較多，但對于SKP2與P57KIP2的相關(guān)性的研究較少，本研究初步證實了在卵巢組織惡變的過程中SKP2參與了P57KIP2的降解。關(guān)于P57KIP2和SKP2的表達及兩者相關(guān)性的進一步闡述,將有助于揭示卵巢黏液腺癌的發(fā)生機制并為臨床治療提供指導意義。

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KIP2,cyclinD1,and cyclinE in epithelial ovarian tumors and survival〔J〕.Hum Pathol,2001,32 (8) :808.

[2] Gustavo B,Barbara B,Paola B,et al.Overexpressed cyclinD3 contributes to retaining the growth inhibitor p27 in the cytoplasm of thyroid tumor cells〔J〕.J Clin Invest,1999,104(7):865.

[3] 虞志強.SKP2蛋白在直腸癌及其遠端切緣組織中表達的臨床意義〔J〕.實用癌癥雜志，2009，5(24):471.

[4] Tsvetkov LM,Yeh KH,Lee SJ,et al.p27kip1 ubiquitination and degradation is regulated by the SCFSKP2 complex through phosphorylated Thr187 in p27〔J〕.Curr Biol,1999,9:661.

[5] Kamura T,Hara T,Kotoshiba S,et al.Degradation of p57(K-IP2) mediated by SCFSKP2-dependent ubiquitylation〔J〕.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2003,100(18):10231.