楊 娟 肖 蘭

P57KIP2蛋白是1種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子(CDKI)，屬CIP/KIP家族，在細(xì)胞周期中起負(fù)調(diào)控作用，能抑制細(xì)胞從 G1期到 S期的轉(zhuǎn)化，進(jìn)而阻止細(xì)胞的增殖，被認(rèn)為具有抑癌基因活性。而SKP2既S期激酶相關(guān)蛋白2，是SCF復(fù)合物的成員之一，能特異性識(shí)別底物并與之結(jié)合,使之進(jìn)入泛素化蛋白酶體降解途徑。有關(guān)在腫瘤發(fā)生發(fā)展中SKP2與P57KIP2表達(dá)的相關(guān)性，目前國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。我們采用免疫組化SP法，檢測(cè)P57KIP2、SKP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中的表達(dá)，比較其表達(dá)與卵巢黏液性腫瘤臨床病理特征的關(guān)系，并探討卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中P57KIP2與SKP2表達(dá)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

本組標(biāo)本均取自孝感市中心醫(yī)院2009年1月～2012年1月手術(shù)切除的標(biāo)本。卵巢黏液腺癌47例,年齡42～76歲，平均年齡61歲；卵巢黏液性交界性腫瘤12例(不包括交界性腫瘤伴微小浸潤(rùn))，均經(jīng)充分取材，未見黏液腺癌成分，年齡39～68歲，平均年齡56歲；卵巢良性黏液性囊腺瘤12例，經(jīng)充分取材，確認(rèn)為良性，年齡40～58歲，平均年齡45歲。卵巢黏液腺癌：高分化11例，中分化26例，低分化10例；TNM分期：Ⅰ期、Ⅱ期共36例，Ⅲ期、Ⅳ期共11例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者10例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者37例。

1.2 試劑

即用型單克隆抗體鼠抗人P57KIP2購(gòu)自福州邁新公司,即用型單克隆抗體鼠抗人SKP2、通用型SP試劑盒及DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

采用免疫組化SP法,具體步驟按說明書進(jìn)行。以PBS液代替一抗作為陰性對(duì)照。P57KIP2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi),以細(xì)胞核染色為主；SKP2陽(yáng)性染色位于細(xì)胞核內(nèi)，均為黃色或棕黃色顆粒，本組切片均無(wú)胞核與胞質(zhì)同時(shí)表達(dá)的現(xiàn)象。每張切片在高倍鏡(×400)下隨機(jī)計(jì)數(shù)1000個(gè)腫瘤細(xì)胞,根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分比計(jì)分:①陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性(-);②5%～24%為弱陽(yáng)性(+);③ 25%～49%為陽(yáng)性(++);④≥50%為強(qiáng)陽(yáng)性(+++) 。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS11.0軟件，采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)、行×列資料的χ2檢驗(yàn)(校正)及Pearson相關(guān)分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 P57KIP2、SKP2蛋白在卵巢各黏液性腫瘤組織中的表達(dá)情況

表1 P57KIP2、SKP2蛋白在卵巢各黏液性腫瘤組織中的表達(dá)情況(例)

a為良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤比較；b為黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌比較；c為良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌比較

由表1可見，卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌組織中P57KIP2陽(yáng)性表達(dá)率分別為100.0%、91.7%、44.7%，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤其陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌、良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中SKP2陽(yáng)性表達(dá)率分別為0、16.7%、36.2%，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤、黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，而良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌其陽(yáng)性表達(dá)率比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.2 P57KIP2、SKP2蛋白表達(dá)與卵巢黏液腺癌臨床病理特征的關(guān)系

P57KIP2、SKP2表達(dá)與卵巢黏液腺癌患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)相關(guān)性(P> 0.05)，與卵巢黏液腺癌組織學(xué)分化及TNM分期相關(guān)(P< 0.05)，在高、中、低分化卵巢黏液腺癌中P57KIP2陽(yáng)性表達(dá)率依次下降，而SKP2陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，見表2。

表2 P57KIP2、SKP2蛋白表達(dá)與卵巢黏液腺癌臨床病理特征的關(guān)系(例)

2.3 P57KIP2、SKP2蛋白在胞質(zhì)中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

10例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，P57KIP2胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)4例，陽(yáng)性率為40.0%(4/10)，37例無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，P57KIP2胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)3例，陽(yáng)性率為8.1%(3/37)，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中SKP2胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)1例，陽(yáng)性率為10.0%(1/10)，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例中，其胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)6例，陽(yáng)性率為16.2%(6/37)，兩者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4 卵巢黏液腺癌組織中P57KIP2與SKP2表達(dá)的相關(guān)性

表3 卵巢黏液腺癌組織中P57KIP2與SKP2表達(dá)的相關(guān)性(細(xì)胞核表達(dá))(例)

由表3可見，卵巢黏液腺癌中P57KIP2蛋白和SKP2蛋白同時(shí)陽(yáng)性表達(dá)有4例(4/21),P57KIP2蛋白和SKP2蛋白同時(shí)陰性表達(dá)有13例(13/26) ，經(jīng)Pearson相關(guān)分析兩者呈負(fù)相關(guān)性(γ=-0.292,P=0.046<0.05)。

3 討論

研究表明P57KIP2蛋白通過與Cyclin-CDK復(fù)合物結(jié)合而抑制CDK活性，P57KIP2 蛋白主要抑制CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2等G1期和S期激酶復(fù)合物,使細(xì)胞不能通過 G1期[1]，從而抑制細(xì)胞的增殖 ，起到腫瘤抑制基因的效應(yīng)。本研究結(jié)果顯示P57KIP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率依次降低，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤其陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而兩者與黏液腺癌陽(yáng)性表達(dá)率比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在黏液腺癌中，P57KIP2表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，其低表達(dá)與腫瘤分化低及TNM分期晚有關(guān)，另外，本研究結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌P57KIP2胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。有學(xué)者提出P27KIP1蛋白在胞質(zhì)中表達(dá)與CyclinD1和CyclinD3過表達(dá)顯著相關(guān),并發(fā)現(xiàn)P27KIP1突變后(CyclinD結(jié)合位點(diǎn)的丟失)，則在核中的表達(dá)增強(qiáng)[2]。由于P57KIP2與P27KIP1是密切相關(guān)的2種CDKI，同屬CIP/KIP家族，在結(jié)構(gòu)上也具有一定的同源性，因此推測(cè)在細(xì)胞惡變的過程中，細(xì)胞核中的CyclinD出現(xiàn)過表達(dá)，P57KIP2在細(xì)胞核中合成后與CyclinD-CDK4結(jié)合并被移致胞質(zhì)，導(dǎo)致胞質(zhì)中P57KIP2表達(dá)水平升高而胞核中P57KIP2表達(dá)水平下降。

本研究結(jié)果顯示，SKP2在卵巢良性黏液性囊腺瘤、黏液性交界性腫瘤、黏液腺癌中陽(yáng)性表達(dá)率依次升高，良性黏液性囊腺瘤與黏液性交界性腫瘤、黏液性交界性腫瘤與黏液腺癌中SKP2陽(yáng)性表達(dá)率比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而良性黏液性囊腺瘤與黏液腺癌中其陽(yáng)性表達(dá)率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在黏液腺癌中SKP2表達(dá)與患者年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，而其高表達(dá)與腫瘤分化低及TNM分期晚有關(guān)，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌SKP2胞質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)率較無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移黏液腺癌有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明了SKP2高表達(dá)與黏液腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。虞志強(qiáng)[3]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)大腸癌中SKP2陽(yáng)性表達(dá)率與脈管內(nèi)癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率呈正相關(guān),顯示SKP2在大腸癌中表達(dá)水平與組織分化程度和TNM分期有關(guān),在低分化大腸癌中呈高表達(dá),且其表達(dá)水平在高、中、低分化癌組織中存在顯著性差異,說明SKP2蛋白過表達(dá)與大腸癌發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。這些結(jié)果都表明，SKP2在細(xì)胞分化過程中發(fā)揮重要作用,因此,SKP2可能作為判斷惡性腫瘤惡性程度的輔助指標(biāo)。

P57KIP2和P27KIP1是2種密切相關(guān)的CDKI，同屬于CIP/KIP家族，兩者的N-末端有40%的同源性，而C-末端均有核觸發(fā)區(qū)域，其中含有磷酸化位點(diǎn)，P57KIP2的磷酸化位點(diǎn)是310位蘇氨酸,P27KIP1的磷酸化位點(diǎn)是187位蘇氨酸。cyclinE-CDK2促使P27KIP1的187位蘇氨酸磷酸化，磷酸化后的P27KIP1能被SKP2識(shí)別而進(jìn)入泛素蛋白酶體途徑被降解[4]，本研究旨在探討磷酸化后的P57KIP2是否也能被SKP2識(shí)別而進(jìn)入泛素蛋白酶體途徑被降解。本研究結(jié)果經(jīng)Pearson相關(guān)分析顯示P57KIP2表達(dá)與SKP2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，從而初步推測(cè)在卵巢粘液性腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中，SKP2參與了P57KIP2的降解，這與Kamura[5]的研究結(jié)果基本一致。目前有研究表明，SKP2是在G1期向S期轉(zhuǎn)換的過程中降解P57KIP2，而在G0/G1過度期也可以觀察到P57KIP2的降解，至于P57KIP2在G0/G1過度期的降解機(jī)制目前仍不清楚，需要進(jìn)一步探討。

所以，在卵巢黏液腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中P57KIP2表達(dá)水平下降的原因推測(cè)如下：① 在卵巢組織惡變的過程中，細(xì)胞核中的cyclinE-CDK2復(fù)合物的活性增強(qiáng)，使P57KIP2磷酸化而被SKP2識(shí)別并進(jìn)入泛素蛋白酶體途徑被降解；②在細(xì)胞惡變的過程中，細(xì)胞核中CyclinD出現(xiàn)過表達(dá)，P57KIP2在細(xì)胞核中合成后與CyclinD-CDK4結(jié)合并被移致胞質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞核中P57KIP2的表達(dá)水平下降；③在卵巢組織惡變的過程中，P57KIP2基因組出現(xiàn)了基因印記缺失或印記錯(cuò)誤導(dǎo)致了基因表達(dá)水平下降。細(xì)胞核中P57KIP2表達(dá)水平下降，使P57KIP2對(duì)CyclinE-CDK2 、CyclinA-CDK2的結(jié)合抑制作用及對(duì)PCNA的結(jié)合抑制作用減弱，從而減弱了對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用，又進(jìn)一步促進(jìn)卵巢組織的惡變。

綜上所述,P57KIP2、SKP2的異常表達(dá)與卵巢黏液腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),P57KIP2抑制卵巢黏液腺癌的發(fā)生發(fā)展，而SKP2促進(jìn)其發(fā)生發(fā)展。P57KIP2、SKP2蛋白的檢測(cè)可為判斷卵巢黏液腺癌的惡性程度提供重要參考。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于SKP2與P27KIP1的相關(guān)性的研究較多，但對(duì)于SKP2與P57KIP2的相關(guān)性的研究較少，本研究初步證實(shí)了在卵巢組織惡變的過程中SKP2參與了P57KIP2的降解。關(guān)于P57KIP2和SKP2的表達(dá)及兩者相關(guān)性的進(jìn)一步闡述,將有助于揭示卵巢黏液腺癌的發(fā)生機(jī)制并為臨床治療提供指導(dǎo)意義。

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