胡鳳娣 鄒天寧 鄧明佳 李 科 沈麗達(dá)

雌激素在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，它通過與雌激素受體(estrogen receptor，ER)α和β(ERα和ERβ)結(jié)合形成復(fù)合物后，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，刺激細(xì)胞核DNA啟動(dòng)蛋白合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖[1]。ERα和ERβ在人體組織內(nèi)分布不一，與配體結(jié)合的特性不同，提示它們可能具有不同的生物學(xué)作用[2]。我們通過半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測(cè)乳腺癌組織、癌旁組織、癌周正常組織的ERα、ERβ mRNA的表達(dá)，探討其在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

所有標(biāo)本系云南省腫瘤醫(yī)院乳腺中心手術(shù)切除，各標(biāo)本組織類型均經(jīng)病理檢查證實(shí)，共45例，均為女性，年齡35～73歲，中位年齡47歲。每例患者均取癌組織、相應(yīng)癌旁組織(距癌灶1～ 2 cm)、相應(yīng)正常腺體(距癌灶>7 cm)。全部組織標(biāo)本獲取前均未經(jīng)化療和(或)放療及內(nèi)分泌治療。標(biāo)本取材后迅速投入液氮中速凍，然后放入-80℃冰箱保存。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取 用TRIzol一步法提取總RNA，DEPC水溶解RNA，電泳檢測(cè)RNA完整性，紫外分光光度計(jì)測(cè)定260 nm和280 nm吸光度，計(jì)算出RNA的濃度和純度。

1.2.2 RT-PCR 擴(kuò)增 取500 ng總RNA，采用One-step RT-PCR 試劑盒(BD公司)，對(duì)ERα、ERβ和β-actin mRNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增ERα上游引物為：5'-CCAGCAGCATGTCGAAGATC-3'，下游引物為：5'-CAACCGTCGAGAGTACAGAGG-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)263 bp；擴(kuò)增ERβ上游引物為：5'-AGTGCGGCTCTTGGAGAGCTG-3'，下游引物為：5'-AGACCAGTGTCGTGGGTCC-3'，產(chǎn)物片段長(zhǎng)472 bp；擴(kuò)增β-action上游引物為5'-TGGACATCCGCAAAGAC-3',下游產(chǎn)物為5'-AGCACTGTG TTGGCGTACAG-3',產(chǎn)物長(zhǎng)301 bp。反應(yīng)參數(shù)設(shè)置如下：50 ℃逆轉(zhuǎn)錄60 min，94 ℃ 5 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶，然后進(jìn)行35個(gè)周期PCR擴(kuò)增反應(yīng)，94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，68 ℃延伸1 min，最后68 ℃延伸2 min。ERα、ERβ和β-actin反應(yīng)條件相同。

1.2.3 RT-PCR產(chǎn)物的半定量分析 RT-PCR 擴(kuò)增后，取5 μl PCR 產(chǎn)物,加少量溴乙啶染色,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。應(yīng)用凝膠成像儀掃描成像。RT-PCR 產(chǎn)物的定量分析，以條帶的大小及深淺判斷ERα、ERβ和β-actin產(chǎn)物量，并經(jīng)圖像分析處理。以平均光密度×條帶面積，表示總光密度,以此代表mRNA 的量。各組織中β-actin表達(dá)穩(wěn)定，故用ERα、ERβ與β-actin產(chǎn)物帶吸光度的比值表示組織標(biāo)本ERα、ERβ相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.4 測(cè)序分析 將ERα、ER β產(chǎn)物凝膠回收，測(cè)序由寶生物公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS17.0軟件包。不同組織中ERα相對(duì)表達(dá)值為非正態(tài)分布，采用秩和檢驗(yàn),并對(duì)ERα和ERβ在乳腺癌組織中的表達(dá)水平與年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期之間的關(guān)系進(jìn)行分析，P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ERα mRNA的表達(dá)

ERα mRNA在45例癌組織中28例表達(dá)，全矩0～0.86，中位數(shù)0.55；癌旁組織24例表達(dá)，全矩0～0.82，中位數(shù)0.54；正常乳腺組織19例表達(dá)，全矩0～0.76，中位數(shù)0.43。表達(dá)為非正態(tài)分布，經(jīng)秩和檢驗(yàn),ERα在癌組織、癌旁組織、正常組織中表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但從正常組織、癌旁組織到癌組織有增高趨勢(shì)。

2.2 ERβ mRNA的表達(dá)

ERβ mRNA在45例癌組織中21例表達(dá)，全矩0～0.77，中位數(shù)0.44；相應(yīng)癌旁組織32例表達(dá)，全矩0～0.90，中位數(shù)0.56；相應(yīng)正常乳腺組織34例表達(dá)，全矩0～1.14，中位數(shù)0.65。乳腺癌組織與相應(yīng)癌旁組織、正常乳腺組織之間ERβ mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。乳腺癌組織中ERα、β mRNA的表達(dá)(圖1)。

圖1 乳腺癌組織中ERα、ERβ的表達(dá)

2.3 ERα、ERβ mRNA的表達(dá)與乳腺癌臨床病理的關(guān)系

ERα mRNA表達(dá)與年齡、原發(fā)腫瘤大小、TNM分期無關(guān) (P>0.05)，而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有關(guān)(P<0.05)；ERβ mRNA表達(dá)與年齡無關(guān)(P>0.05)，而與原發(fā)腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況有關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 乳腺癌組織ERα、ERβ表達(dá)的中位數(shù)與臨床特征的關(guān)系

3 討論

雌激素受體不僅是乳腺癌重要的預(yù)后指標(biāo)之一，也是乳腺癌內(nèi)分泌治療的重要靶點(diǎn)。ER有2種亞型:

一種為傳統(tǒng)的ERα,另一種為后來研究發(fā)現(xiàn)的ERβ。臨床所進(jìn)行的ER檢測(cè)主要是對(duì)ERα的檢測(cè)。ERβ的出現(xiàn)使人們重新評(píng)估雌激素受體的生物學(xué)功能及其在乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展及耐藥機(jī)理方面的意義。ERβ與ERα有高度同源性，但ERα基因位于染色體6q24區(qū)段，而ERβ基因則位于14q22～24區(qū)段，兩者的結(jié)構(gòu)差異決定了其功能的差異[3]。另外，ERα和ERβ組織分布不一，與配體結(jié)合特性不同，提示它們可能具有不同的生物學(xué)作用[2]。

本研究對(duì)45例正常乳腺組織檢測(cè)結(jié)果顯示，ERα與ERβ均有表達(dá)，并且ERβ表達(dá)顯著高于ERα,提示ERβ的表達(dá)可能在正常乳腺細(xì)胞中發(fā)揮更重要的作用，ERβ可能是正常乳腺的優(yōu)勢(shì)雌激素受體。多數(shù)研究[4，5]表明,ERβ對(duì)正常乳腺組織具有保護(hù)作用,可對(duì)抗ERα的促腫瘤生長(zhǎng)作用,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，其表達(dá)缺失可能對(duì)乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展具有極其重要的意義。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)癌組織、癌旁組織及正常乳腺組織中ERα檢測(cè)，比較其基因表達(dá)水平的差異，結(jié)果雖然沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但可以看出在癌變過程中ERα的表達(dá)呈上升趨勢(shì)。ERβ在癌組織中表達(dá)明顯低于正常組織，提示ERβ的缺失會(huì)降低其對(duì)乳腺的保護(hù)作用，引起癌變。本研究中ERα陽性組，ERβmRNA表達(dá)低于陰性組，提示ERα與ERβ在腫瘤發(fā)生過程中存在著相互作用，ERαmRNA表達(dá)可能下調(diào)ERβmRNA。ERα的上調(diào)與ERβ的下調(diào)，協(xié)同輔助因子表達(dá)失衡，可能直接或間接造成乳腺細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)紊亂，使細(xì)胞增生更活躍，修復(fù)不完全，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡變。Williams等[6]通過構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)ERβ的T47D細(xì)胞系，對(duì)該細(xì)胞中35 000個(gè)基因的mRNA基因組表達(dá)譜進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERβ激活后可抑制ERα對(duì)其靶基因的調(diào)節(jié)作用,并可改變某些ERβ特異性靶基因的表達(dá)。

目前對(duì)ERα在乳腺癌中的作用已進(jìn)行了較多研究,并已達(dá)成共識(shí),而對(duì)ERβ在乳腺癌中的作用還存在較大爭(zhēng)議。本研究發(fā)現(xiàn)癌組織中ERβ表達(dá)與患者年齡無關(guān)，與腫瘤大小、病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。ERβ在癌變過程中表達(dá)逐漸降低，且與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀況負(fù)相關(guān)的表達(dá)，證明ERβ可能是1種保護(hù)性的雌激素受體，ERβ陽性腫瘤侵襲性低。近來,越來越多的研究表明ERβ可能作為乳腺癌新的預(yù)后指標(biāo)[7],但它與乳腺癌的發(fā)展及預(yù)后關(guān)系,各家報(bào)道并不一致。Vesna 等[8]發(fā)現(xiàn),在腫瘤體積大于20 mm的病例中,ERβ1和ERβ5的表達(dá)顯著降低,表明在腫瘤發(fā)展過程中ERβ的轉(zhuǎn)錄下調(diào)。這一發(fā)現(xiàn)與ERβ為抑癌基因的假說吻合。Zhao等[9]對(duì)HEK293乳腺癌細(xì)胞系研究表明，ERβ2能夠抑制ERα的表達(dá),從而解釋ERβ2總是伴隨ERα陰性表型的現(xiàn)象,該研究證實(shí)了ERβ2對(duì)ERα介導(dǎo)的乳腺癌發(fā)展的影響作用。但近期一項(xiàng)283例浸潤(rùn)性乳腺癌的研究表明腫瘤分期較高的病例中胞質(zhì)ERβ水平較高[10]。

ERβ的發(fā)現(xiàn)和研究為乳腺癌患者(尤其為ER陰性乳腺癌患者)的內(nèi)分泌治療研究提供了新的視角。對(duì)于ERα陽性的乳腺癌患者，應(yīng)給予雌激素受體拮抗劑治療，有研究表明，即使ER、PR均陽性的乳腺癌患者，也有約1/3對(duì)內(nèi)分泌治療抵抗，部分乳腺癌細(xì)胞甚至被他莫昔芬刺激生長(zhǎng)[11]。既往有研究表明在ERα陰性的乳腺癌中給予雌激素受體拮抗劑他莫昔芬治療后，ERβ陽性組較陰性組臨床預(yù)后好，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[12，13]。ERβ信號(hào)通道能否成為ERα陰性乳腺癌患者的內(nèi)分泌靶向治療目標(biāo)，尚需進(jìn)一步研究。本研究為進(jìn)一步探索ERβ在乳腺中的正常生理作用，以及為乳腺癌的發(fā)生和生存預(yù)后分析提供了臨床研究依據(jù),而進(jìn)一步研究也可能為乳腺癌內(nèi)分泌藥物研發(fā)提供新的治療靶點(diǎn),為預(yù)后判斷及指導(dǎo)治療提供臨床依據(jù)。

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