陸冰穎 余進(jìn)進(jìn) 李澤明

2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)為葡萄糖類似物，具有抑制病毒及細(xì)菌感染及延緩衰老等作用，作為糖酵解抑制劑的1種，基于“瓦博格效應(yīng)”的抗腫瘤潛在能力受到關(guān)注，已有研究顯示，2-DG可抑制某些腫瘤細(xì)胞的增殖，但對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖的影響尚少見(jiàn)報(bào)告，本研究觀察了體外環(huán)境下2-DG對(duì)人卵巢癌增殖及凋亡的影響，為卵巢癌的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院饋贈(zèng)；實(shí)驗(yàn)藥物2-脫氧-D-葡萄糖購(gòu)自Alfa Aesar公司；RPMI-1640、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、Annexin Ⅴ/PI雙染凋亡試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；0.25%不含EDTA胰酶購(gòu)自杭州吉諾公司；標(biāo)準(zhǔn)新生牛血清購(gòu)自杭州四季青生物公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞培養(yǎng)在含10%新生牛血清和青鏈霉素雙抗的RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2天換液1次，待細(xì)胞鋪滿瓶底70%～80%時(shí)，用PBS洗2次，用0.25%胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液繼續(xù)傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞抑制率 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液后，調(diào)整細(xì)胞密度為5 000個(gè)/100 μl，接種于 96 孔板中，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸盡培養(yǎng)基，加入不同濃度的藥物(2.5 mmol/L、5 mmol/L 、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L)各100 μl，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)終止前4 h每孔加入50 μl的1×MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸盡上清液，每孔加入DMSO 150 μl，微振蕩器上振蕩溶解10 min，以空白對(duì)照孔調(diào)零，在自動(dòng)酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(A)值。細(xì)胞抑制率(%)= 1-(實(shí)驗(yàn)組A值-空白對(duì)照組A值)/(陰性對(duì)照組A值-空白對(duì)照組A值)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以最適細(xì)胞濃度接種于96孔板中，設(shè)陰性對(duì)照組及10 mmol/L 2-DG處理組，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h，棄上清，加入適量Hoechst33258染液，室溫避光反應(yīng)10 min后于熒光倒置相差顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV-3細(xì)胞，PBS洗兩遍，消化制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為50萬(wàn)個(gè)/ml接種于六孔板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入不同濃度的2-DG(5 mmol/L 、10 mmol/L、20 mmol/L)2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集單細(xì)胞懸液，低速離心5 min(1 000轉(zhuǎn)/min)后棄上清，冷PBS洗2次，緩慢加入預(yù)冷70%無(wú)水乙醇1 ml，4℃固定過(guò)夜。低速離心5 min(1000轉(zhuǎn)/min)棄上清，冷PBS洗2次，加入100 μl Rnase A置于37℃水浴30 min，加入400 μl PI避光染色混勻，4℃避光反應(yīng)30 min，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡或壞死 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，以50萬(wàn)個(gè)/ml的濃度接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，加入10 mmol/L 2-DG 2 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用不含EDTA的0.25%胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，冷PBS洗2次(1000轉(zhuǎn)/min)，加入500 μl的Binding Buffer緩沖液懸浮細(xì)胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻，再加入5 μl PI混勻，室溫下避光反應(yīng)10～15 min，上機(jī)檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞抑制率

2-DG對(duì)SKOV-3細(xì)胞抑制作用見(jiàn)圖1。2-DG可抑制SKOV-3細(xì)胞生長(zhǎng)，且這種抑制作用隨作用濃度的增加或作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，具有劑量和時(shí)間依賴性(P<0.05)。

圖1 不同濃度2-DG對(duì)SKOV-3細(xì)胞抑制率

2.2 Hoechst染色觀察細(xì)胞凋亡

經(jīng)Hoechst染色后于熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組SKOV-3細(xì)胞核比較大，熒光分布較均勻且較弱；2-DG作用24 h后，可見(jiàn)SKOV-3細(xì)胞呈不同程度核皺縮、破裂及染色質(zhì)濃縮、邊移，形態(tài)不規(guī)則，可見(jiàn)凋亡小體，熒光下成高亮，即典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)，見(jiàn)圖2。

圖2 熒光顯微鏡下細(xì)胞凋亡形態(tài)變化

2.3 2-DG對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞周期的影響

由表1可見(jiàn)，隨著2-DG濃度增加，處于G0/G1期的人SKOV-3細(xì)胞逐漸增多，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，結(jié)果表明2-DG通過(guò)阻滯細(xì)胞于G0/G1期，從而達(dá)到抑制細(xì)胞增殖的作用。

表1 2-DG對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞周期的影響

2.4 2-DG對(duì)人卵巢癌SKOV-3細(xì)胞凋亡的影響(圖3)

流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：對(duì)照組(A)細(xì)胞凋亡率為(2.94±0.45)%；2-DG處理組(B)細(xì)胞凋亡率為(17.45±0.62)%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SKOV-3細(xì)胞凋亡情況

3 討論

體內(nèi)大多數(shù)正常細(xì)胞(紅細(xì)胞等除外)主要通過(guò)葡萄糖的有氧氧化獲得ATP，而腫瘤細(xì)胞即使在有氧條件下仍依靠糖酵解獲取能量，這就是“瓦博格效應(yīng)”[1]，由于糖酵解產(chǎn)生的能量遠(yuǎn)少于有氧氧化的產(chǎn)量，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞需要更多的葡萄糖來(lái)維持生長(zhǎng)代謝，基于腫瘤細(xì)胞代謝的這種特點(diǎn)，以18F標(biāo)記的2-DG通過(guò)正電子發(fā)射斷層掃描成像(PET-CT)來(lái)作為早期發(fā)現(xiàn)和診斷腫瘤疾病的手段之一，也再次引起人們對(duì)“瓦博格效應(yīng)”的關(guān)注[2]。

2-脫氧-D-葡萄糖(2-DG)又名2-去氧甘露糖、2-去氧-D-阿拉伯已糖或天然無(wú)毒單糖，非代謝型天然稀有六碳糖，是多柔比星、正定霉素、洋紅霉素及大環(huán)內(nèi)脂類抗生素等抗癌藥物的基本結(jié)構(gòu)單位[3]。已有研究顯示，2-DG進(jìn)入細(xì)胞后被已糖激酶磷酸化，生成的2-DG-6P不能被代謝，從而聚積在細(xì)胞內(nèi)，競(jìng)爭(zhēng)性抑制已糖激酶與葡萄糖的反應(yīng)，減少G-6-P的生成，限制了糖酵解后繼反應(yīng)的發(fā)生，減少了ATP的生成，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的周期阻滯和死亡[4]。Kern等[5]把F344大鼠分為3組，皮下接種不同數(shù)量的纖維肉瘤細(xì)胞(2×106個(gè)細(xì)胞，1×107個(gè)細(xì)胞和1 mm腫瘤組織)，于接種后第3天隨機(jī)分配接受不同濃度2-DG(劑量分別為0.75 g/kg、1.5 g/kg、1.75 g/kg，)處理，生理鹽水作為對(duì)照組，10天后收集腫瘤細(xì)胞與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組腫瘤細(xì)胞重量減少50%～70%，且細(xì)胞毒性隨著2-DG濃度的增加而增強(qiáng)。已有研究顯示在移植人骨肉瘤和非小細(xì)胞肺癌的裸鼠實(shí)驗(yàn)中，2-DG可提高阿霉素或紫杉醇抗腫瘤作用[6]。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度2-DG對(duì)人卵巢癌SKOV-3具有增殖抑制作用：MTT比色法顯示2-DG可抑制細(xì)胞增殖，且具有時(shí)間和濃度依賴性；Hoechst染色可在熒光顯微鏡下觀察到凋亡小體及細(xì)胞核不同的形態(tài)變化；細(xì)胞周期結(jié)果顯示，2-DG可阻滯卵巢癌SKO-V-3細(xì)胞于G0/G1期，可能是2-DG作用于細(xì)胞的S期，抑制DNA合成，阻礙細(xì)胞由G1期向S期轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致G0/G1期細(xì)胞增多，從而減慢了腫瘤細(xì)胞的增殖速度；細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，2-DG處理組的凋亡區(qū)和壞死區(qū)的細(xì)胞較對(duì)照組明顯增多，表明2-DG是通過(guò)壞死和凋亡誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的。

有研究顯示，2-DG可以以劑量依賴性方式，通過(guò)選擇性增敏腫瘤細(xì)胞提高放療有效性的同時(shí)保護(hù)正常細(xì)胞，Ⅰ/Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)表明，腦膠質(zhì)瘤患者口服劑量為200 mg/kg，接受γ射線輻射治療的患者仍能很好的耐受[7]。

卵巢癌是婦科常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率高居?jì)D科惡性腫瘤之首，目前臨床治療原則以手術(shù)為主，輔以化療等綜合治療[8]，但由于抗腫瘤藥物對(duì)體內(nèi)正常細(xì)胞的殺傷作用以及耐藥的產(chǎn)生，使尋求新的治療藥物成為迫切需要。2-DG已被驗(yàn)證可以在多個(gè)腫瘤細(xì)胞中阻滯細(xì)胞周期并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，深入研究2-DG作用機(jī)制可能成為治療腫瘤的新手段。

[1] Warburg O.On the origin of cancer cells〔J〕.Science,1956,123(3191):309.

[2] Gambhir S S.Molecular imaging of cancer with positron emission tomography〔J〕.Nat Rev Cancer，2002，2(9)：683.

[3] 李繼珩，姚麗亞，馬 玉.2-去氧葡萄糖的研究進(jìn)展〔J〕.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2010,29(10):1323.

[4] Zhang XD，Deslandes E，VilledieuM，et al.Effect of 2-deoxy-D-glucose on various malignant cell lines in vitro〔J〕.Anticancer Research,2006,26(5A)：3561.

[5] Kern KA,Norton JA.Inhibition of established rat fibrosarcoma growth by the glucose antagonist 2-deoxy-D-glucose〔J〕.Surgery,1987,102:380.

[6] Maschek G，Savaraj N，Priebe W，et al.2-Deoxy-D-glucose increases the efficacy of adriamycin and paclitaxel in human osteosarcoma and non-small cell lung cancers in vivo〔J〕.Cancer Res，2004，64(1)：31.

[7] Singh D，Banerji A K，Dwarakanath B S，et al.Optimizing cancer radiotherapy with 2-deoxy-D-Glucose does escalation studies in patients with glioblastoma multiforme〔J〕.Strahlenther Onkol，2005,181(8)：507.

[8] 高永良，高國(guó)蘭.卵巢癌治療的新策略〔J〕.實(shí)用癌癥雜志，2005,20(2)：204.