李 響 梁健剛 關(guān) 中 徐志堅(jiān) 彭解人

喉癌是近年來發(fā)病率逐漸提高的1種頭頸部常見的惡性腫瘤。放射治療可保留喉功能，提高患者生存質(zhì)量，在喉癌的綜合治療中起著重要的作用，但是腫瘤細(xì)胞的乏氧狀態(tài)可導(dǎo)致放射耐受、放療失敗[1，2]。研究表明，乏氧不僅影響放療效果，還是影響手術(shù)治療[3]及某些化療藥物治療效果[4]的不良因素。放射增敏法為解決乏氧耐受的1種重要方法，甘氨雙唑鈉是1種具有良好的放療增敏效應(yīng)且不良反應(yīng)較低的放射增敏劑。臨床研究表明其可提高頭頸部腫瘤的療效，但主要入選病例為鼻咽癌及口咽癌患者，尚無針對(duì)喉癌的基礎(chǔ)研究及臨床隨機(jī)雙盲試驗(yàn)研究。本研究觀察甘氨雙唑鈉對(duì)離體乏氧人喉癌細(xì)胞株(Hep-2)的放射增敏作用，并初步探討其放射增敏機(jī)制，以期為喉癌的臨床放射增敏治療提供基礎(chǔ)研究資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

喉癌細(xì)胞株Hep-2購自中南大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室，放射增敏劑甘氨雙唑鈉(商品名希美納)購自山東綠葉制藥有限公司，99.99%氮?dú)赓徸詮V州氣體廠，培養(yǎng)基RPMI 1640購自GIBCO公司。德國西門子PRIMUS直線加速器。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

喉癌細(xì)胞株Hep-2采用RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%新生牛血清)，置于25 cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)。

1.3 乏氧細(xì)胞建立方法

實(shí)驗(yàn)組為乏氧照射組，對(duì)照組為常氧照射組。實(shí)驗(yàn)組選擇處于對(duì)數(shù)生長期的喉癌細(xì)胞(Hep-2)，向培養(yǎng)瓶內(nèi)通入99.99%的高純氮(流量0.5 L/min，時(shí)間45 min)進(jìn)行乏氧，兩組均予0 Gy、2 Gy、4 Gy、8 Gy、12 Gy、16 Gy照射劑量，分別單次照射后，接種6孔板，通過克隆形成試驗(yàn)，驗(yàn)證乏氧模型的建立。

1.4 照射方法

6MV直線加速器，照射劑量為200 cGy/min,X線照射，源皮距為100 cm，射野大小為20 cm×20 cm。

1.5 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制及活性差異

實(shí)驗(yàn)組為加藥乏氧照射組，并根據(jù)CMNa的不同濃度(0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1.0 mmol/L)分為3組；不加藥單純乏氧照射組為對(duì)照組。照射劑量為4 Gy、8 Gy。將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，調(diào)整細(xì)胞數(shù)，使每瓶為5×105個(gè)。實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組均先進(jìn)行乏氧，然后加入藥物進(jìn)行照射。照射后以每孔約2 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h 后應(yīng)用酶標(biāo)儀在490 nm處測(cè)定各孔吸光度OD值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。腫瘤細(xì)胞存活率(%)=(加藥孔細(xì)胞OD值/對(duì)照孔細(xì)胞OD值)×100%。腫瘤細(xì)胞抑制率(%)=1-腫瘤細(xì)胞存活率。

1.6 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)CMNa對(duì)乏氧Hep-2細(xì)胞的放射增敏作用

實(shí)驗(yàn)分組同1.5。按上述方法進(jìn)行乏氧、加藥及放射處理(0、2 、4 、8 、12 及16 Gy照射劑量)2 h后，分別梯度接種細(xì)胞于6孔板中，每組重復(fù)3次。7～10天后肉眼可見細(xì)胞克隆時(shí)，停止培養(yǎng)，結(jié)晶紫染色。光鏡下觀察，計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落數(shù)?？寺〗臃N率(PE)=(對(duì)照組克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%；存活分?jǐn)?shù)(SF)=克隆數(shù)/(接種細(xì)胞數(shù)×PE) ；應(yīng)用多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)n擬合劑量存活曲線，得出N、D0、Dq和SF2等放射生物學(xué)參數(shù)；根據(jù)D0、Dq值，按公式增敏比(SER)=單純乏氧對(duì)照組D0/增敏乏氧實(shí)驗(yàn)組D0，計(jì)算CMNa的放射增敏比。

1.7 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期變化

將實(shí)驗(yàn)各組照射2 h后的細(xì)胞樣品處理后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 乏氧細(xì)胞的建立

根據(jù)數(shù)據(jù)(表1)，應(yīng)用多靶單擊模型S=1-(1-e-D/D0)n擬合劑量存活曲線，計(jì)算常氧狀態(tài)D0為0.71，乏氧狀態(tài)D0為1.88，氧增比OER為2.63，其值介于2.5～3.0時(shí)，認(rèn)為達(dá)到乏氧條件。

表1 乏氧組與常氧對(duì)照組克隆平均數(shù)±s)

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制及活性的差異

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示同一放射劑量下，乏氧細(xì)胞的OD值隨甘氨雙唑鈉濃度的增高而減少，不同放射劑量下，細(xì)胞生長抑制曲線隨劑量增大而增陡(表2)。由單因素方差分析得F4 Gy=19.6，F(xiàn)8 Gy=21.5,P4 Gy=0.023,P8 Gy=0.029,P<0.05，進(jìn)一步經(jīng)Dunnett-t檢驗(yàn)，同一照射劑量下任意實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組在細(xì)胞生長情況上均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，初步判斷甘氨雙唑鈉對(duì)離體乏氧細(xì)胞具有放射增敏作用。

表2 4 Gy及8 Gy劑量照射后不同濃度甘氨雙唑鈉的放射增敏作用±s)

2.3 克隆形成試驗(yàn)檢測(cè)CMNa的放射增敏作用

加入不同濃度CMNa的乏氧放射組和單純乏氧放射組的細(xì)胞劑量存活曲線見圖1，其SER、D0、Dq及SF2的值見表3。表明在不同放射劑量下，CMNa的SER值隨濃度增大而增加，D0、Dq及SF2值隨濃度增大而減小。

表3 不同濃度甘氨雙唑鈉放射增敏作用的放射生物學(xué)參數(shù)

2.4 CMNa聯(lián)合放療對(duì)乏氧Hep-2細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測(cè)甘氨雙唑鈉作用于乏氧喉癌細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞周期的改變見表4和圖2。結(jié)果顯示在同一劑量照射下，與單純乏氧對(duì)照組比較，甘氨雙唑鈉作用于乏氧喉癌細(xì)胞后，使G2/M期細(xì)胞比例上升，G1/S期細(xì)胞比例下降。單因素方差分析及Dunnett-t檢驗(yàn)結(jié)果顯示：同一照射劑量、不同濃度甘氨雙唑鈉作用乏氧細(xì)胞后，G2/M期細(xì)胞比例呈上升趨勢(shì)(F=4.41,P=0.004<0.05)，G1/S期細(xì)胞比例呈下降趨勢(shì)(F=7.93,P=0.012<0.05)，呈濃度依賴性。

表4 不同照射劑量各組細(xì)胞周期的改變±s)

圖1 各組照射后乏氧喉癌細(xì)胞生存曲線圖

圖2 4 Gy照射劑量下各組細(xì)胞周期的改變

3 討論

喉癌作為1種對(duì)放射中度敏感的惡性實(shí)體腫瘤，腫瘤內(nèi)存在相當(dāng)一部分的乏氧細(xì)胞是其產(chǎn)生放射抗拒的主要原因[5,6]。甘氨雙唑鈉是1種新型的乏氧細(xì)胞增敏劑，但目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)報(bào)道多為甘氨雙唑鈉對(duì)常氧狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞的影響[7]，尚未對(duì)乏氧喉癌細(xì)胞的研究。臨床研究報(bào)道中，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期試驗(yàn)[8,9]表明甘氨雙唑鈉可提高頭頸部腫瘤、食管癌[10]、肺癌的CR，但主要入選病例為鼻咽癌及口咽癌患者。因此，本實(shí)驗(yàn)探索CMNa對(duì)乏氧Hep細(xì)胞是否有放射增敏作用。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，CMNa對(duì)乏氧細(xì)胞的IC50分別為35.7 mmo1/L和23.50 mmo1/L,可采用 0.1～1.38 mmo1/L對(duì)離體細(xì)胞進(jìn)行增敏。本實(shí)驗(yàn)選擇CMNa濃度為0.1 mmo1/L、0.5 mmo1/L和1.0 mmo1/L，遠(yuǎn)小于IC50的低細(xì)胞毒性(20%IC50以下3～4個(gè)濃度)的有效濃度進(jìn)行增敏試驗(yàn)。

乏氧方法目前已有專門的乏氧細(xì)胞培養(yǎng)箱，但受限于實(shí)驗(yàn)設(shè)備條件，本實(shí)驗(yàn)根據(jù)傳統(tǒng)乏氧方法[12]進(jìn)行乏氧并驗(yàn)證模型成立。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CMNa組存活率(OD值)均顯著低于不加藥的對(duì)照組，且隨CMNa濃度的增加而下降，初步驗(yàn)證CMNa的放射增敏作用。但該方法具有一定局限性，即MTT結(jié)晶物形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比，但無法衡量腫瘤細(xì)胞的無限增殖活性。

克隆形成實(shí)驗(yàn)是評(píng)估照射殺傷效果的經(jīng)典方法，照射之后能夠形成克隆的被認(rèn)為是有無限分裂能力的腫瘤細(xì)胞，可彌補(bǔ)MTT法的不足?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果表明CMNa對(duì)離體乏氧喉癌細(xì)胞具有明顯的放射增敏作用。在不同藥物濃度下，CMNa的SER值隨濃度增大而增加，D0、Dq及SF2值隨濃度增大而減小，說明CMNa對(duì)乏氧細(xì)胞的放射增敏性隨濃度增大而增強(qiáng)，放射抵抗性隨濃度增大而減弱，呈濃度依賴關(guān)系。

在增敏機(jī)制方面，1963年Adams提出的“親電子理論”指出放射增敏劑可使受放射損失的靶分子自由基不能重獲電子而影響修復(fù)，增加射線對(duì)腫瘤細(xì)胞的原發(fā)性損傷。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，更多的放射增敏機(jī)制被揭示出來，如通過分子靶向藥物及細(xì)胞信號(hào)通路傳導(dǎo)途徑[13]、細(xì)胞周期調(diào)控[14]、促進(jìn)凋亡[15]、抑制DNA雙鏈斷裂修復(fù)[16]等。

細(xì)胞周期調(diào)控理論指出處于細(xì)胞周期不同時(shí)相的細(xì)胞其放射敏感性具有很大差異。其中，G2/M期放射敏感性最高，G1/S期次之，S后期及G1期具有很強(qiáng)的放射抵抗性[17]。因此，促使腫瘤細(xì)胞由放射抵抗的G1/S期進(jìn)入并阻滯在G2/M期，是提高腫瘤放射敏感性、改善放療效果的重要途徑。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)甘氨雙唑鈉放射增敏機(jī)制除增加對(duì)DNA原發(fā)性損傷外，還與細(xì)胞周期調(diào)控有關(guān)。不同濃度甘氨雙唑鈉作用后，乏氧喉癌細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例有上升趨勢(shì)，而G1/S期細(xì)胞比例具有下降趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)分析表明甘氨雙唑鈉可以促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入并阻滯在放射敏感的G2/M期，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，呈劑量依賴關(guān)系。

綜上所述，甘氨雙唑鈉對(duì)乏氧喉癌Hep-2腫瘤細(xì)胞具有放射增敏性，其機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入放射敏感的G2/M期有關(guān)，但對(duì)于喉癌患者的放射增敏作用還有待專門針對(duì)喉癌的臨床隨機(jī)實(shí)驗(yàn)研究。

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