胡佳樂 徐立軍 徐之明 陳海飛 沈紅石 李征洋 唐杰慶 王 靜 吳天勤

隨著腫瘤發(fā)生率的增高，腫瘤放射治療也隨著增多。接受放療的惡性腫瘤患者的機體都不可避免遭受到放射、輻射帶來的傷害。然而，大劑量的放療、化療可損傷骨髓基質細胞，嚴重影響造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSC)的植入及造血功能的恢復[1～3]。間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)是存在于骨髓中的1種具有多向分化潛能的干細胞，可以增殖分化為各種骨髓基質細胞，能分泌多種造血調節(jié)因子，在造血調控過程中起著非常重要作用[4～6]。MSC的異常可引起間質細胞的生長過度或停滯和引起造血調節(jié)因子的分泌異常，最終可導致造血系統(tǒng)紊亂[7]。因此，我們將體外培養(yǎng)擴增的人骨髓MSC(hBMSC)與人臍血(umbilical cord blood，UCB)CD34+造血干細胞(UCB HSC)共移植給經60Co γ射線照射的NOD/SCID小鼠，觀察其對造血重建的影響，為hBMSC臨床應用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 共體細胞

hBMSC，由本實驗室分離、培養(yǎng)和鑒定(相關資料另文發(fā)表)；UCB HSC，購自中國醫(yī)學科學院血液病研究所。

1.2 實驗動物及分組

30只NOD/SCID小鼠，購自中國科學院上海實驗動物中心，6～8周齡，體重18～20 g，小鼠飼養(yǎng)于SPF級環(huán)境中，飼料、飲水、墊料及籠具等物品均經高壓蒸氣滅菌。隨機平均分成5組，除正常對照組(未照射組6只)外，另4組24只NOD/SCID小鼠均給予60Co γ射線照射，照射劑量為350 cGy，劑量率為20 cGy/min。除陰性對照組6只不輸入任何細胞，另3組實驗組(18只)經60Co γ射線照射的NOD/SCID小鼠作為細胞移植受體[8]。

1.3 細胞移植

3組實驗組小鼠照射后4 h內經外側尾靜脈輸注上述供體細胞，每只小鼠液體總輸注量為0.2 ml。實驗1組：6只，單純輸入UCB HSC 5×106/ml；實驗2組：6只，輸入UCB HSC 5×106/ml和hBMSC 5×106/ml；實驗3組：6只，輸入UCB HSC 5×106/ml和hBMSC 5×108/ml。

1.4 觀測指標

細胞移植后繼續(xù)無菌飲食喂養(yǎng)，觀察各組小鼠的一般情況和形態(tài)變化，包括小鼠存活情況，皮膚黏膜是否有潰爛、出血，毛發(fā)有無缺損等。移植3周后，每周尾靜脈取血，檢測外周血單個核細胞(MNC)的數量。移植6周后，檢測人源供體細胞嵌合情況：實驗組小鼠斷頸處死后，取其股骨骨髓，制成骨髓細胞懸液100 μl，并調整細胞濃度至1×106/ml，加入20 μl FITC標記的單抗CD45，室溫下避光孵育30 min，再加入2 ml溶血素，室溫下作用10 min，然后用PBS液洗滌2次，加PBS液至0.5 ml，上機檢測。陰性對照：鼠抗鼠IgG1-FITC直標。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 移植后小鼠外觀情況

陰性對照組和實驗1組小鼠均于2周內死亡，經病理檢查確診，均死于骨髓衰竭。實驗2、3組小鼠均存活，并保持良好的生存狀態(tài)，皮膚黏膜無潰爛、出血現(xiàn)象，毛發(fā)無缺損，未發(fā)生明顯的移植物抗宿主病(graft versus host disease，GVHD)，移植4周后，狀態(tài)接近正常對照組。

2.2 移植后小鼠血象情況

移植后第3周，實驗3組外周血MNC數量為(2.66±0.24)×109/L，高于實驗2組(1.35 ± 0.20)×109/L(P<0.01)；實驗2、3組外周血象逐漸回升；第5周，實驗2、3組外周血中MNC水平均接近正常值(表1)。

表1 外周血MNC數量變化

2.3 移植后小鼠供體細胞嵌合情況

移植后第7周，實驗2、3組小鼠外周血均檢測出供體細胞；實驗3組人源細胞嵌合比例為(7.45±0.72)%，高于實驗2組[(5.12±0.06)%] (P<0.05)。

3 討論

本組研究發(fā)現(xiàn)，經60Co γ射線照射NOD/SCID小鼠，不輸注細胞和單純輸注UCB HSC的2組小鼠均于2周內死于造血功能衰竭；而聯(lián)合輸入UCB HSC和hBMSC的 2組小鼠在移植后造血均獲重建，皮膚黏膜無潰爛、出血現(xiàn)象，也無明顯GVHD發(fā)生。說明單純輸入UCB HSC，植活困難；UCB HSC的成功植入和造血的重建必須有基質成分的協(xié)同作用。本研究結果還顯示，UCB HSC聯(lián)合hBMSC移植時，效果與hBMSC用量有關，與5×106/ml組比較，hBMSC用量為5×108/ml組小鼠外周血MNC含量較高，外周血象恢復也較快；穩(wěn)定植入后，供體細胞嵌合率較高。這可能與hBMSC為造血提供了重要的細胞間接觸和生長因子有關[9，10]。hBMSC也可能通過誘導歸巢受體表達而引導造血干細胞歸巢[11]，還可能是基質細胞組分重建后分泌的大量UCB HSC生長刺激因子，誘導了部分hBMSC向造血細胞的分化[12]。總之，NOD/SCID小鼠致死劑量照射后，聯(lián)合輸入UCB HSC和hBMSC可明顯促進造血干細胞移植后的造血重建，且輸入hBMSC并不增高GVHD發(fā)生率，這為臨床應用hBMSC聯(lián)合UCB HSC移植治療造血障礙性疾病及多種惡性血液病提供了科學依據。

[1] Galotto M，Berisso G，Delfino L，et al.Stromal damage as consequence of high-dose chemo/radiotherapy in bone marrow transplant recipients〔J〕.Exp Hematol，1999，27:1460.

[2] Mahmud N，Pang W，Cobbs C，et al.Studies of the route of administration and role of conditioningwith radiation on unrelated allogeneicm is matched mesenchymal stem cell engraftment in a nonhuman primatesmodel〔J〕.Exp Hematol，2004，32:494.

[3] 侯如蓉，酈守國，林志安.放射性肺損傷的研究進展〔J〕.實用癌癥雜志，2011，26(5):531.

[4] Lazarus HM，Koc ON，Devine SM，et al.Cotransplantation of HLA identical sibling culture-expandedmesenchymal stem cells and hematopoietic stem cells in hematologic malignancy patients〔J〕.Biol Blood Marrow Transplant，2005，11:389.

[5] Ball LM，Bernardo ME，Roelofs H，et al.Cotransplantation of exvivo expanded mesenchymal stem cells accelerates lymphocyte recovery and may reduce the risk of graft failure in haploidentical hematopoietic stem cell transplantation〔J〕.Blood，2007，110:2764.

[6] Le-Blanc K，Samuelsson H，Gustafsson B,et al.Transplantation of mesenchymal stem cells to enhance engraftmentofhematopoietic stem cells〔J〕.Leukemia，2007，21:1733.

[7] Heike T，Nakahata T.Stem cellplasticity in the hematopoietic system〔J〕.Int J Hematol，2004，79(1):7.

[8] 許 蕓，鄔 蒙.低劑量輻射誘導小鼠骨髓單個核細胞γH2AX形成的時間劑量效應〔J〕.實用癌癥雜志，2009，24(4):333.

[9] Brouard N，Chapel A，Neildez-Nguyen TM，et al.Transplantation of stromal cells transduced with the human IL3gene to stimulate hematopoiesis in human fetalbone grafts in non-obese，diabetic-severe combined immunodeficiency mice〔J〕.Leukemia，1998，12(7):1128.

[10] Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et al.Phenotypic and functional comparison ofcultures ofmarrow-derivedmesenchymal stem cells (MSCs stem) and stromal cells〔J〕.J Cell Physiol，1998，176(1):57.

[11] Blair A，Thomas DB.Preferential adhesion of fetal liver derived primitive haemopoietic progenitor cells to bone marrow stroma〔J〕.Br J Haematol，1997，99:726.

[12] Rafi S，Mohle R，Shapiro F，et al.Regulation of hematopoiesis by microvascular endothelium〔J〕.Leuk Lymphoma，1997，27:375.