付 敏 何 軍 余 冰 鄭 萍 黃志清 毛湘冰 虞 潔 陳代文

(四川農(nóng)業(yè)大學動物營養(yǎng)所，雅安 625014)

菜籽餅在我國產(chǎn)量大，價格較低，且蛋白質(zhì)含量在30%以上，是一種潛力很大的蛋白質(zhì)飼料資源。但是，菜籽餅含有硫葡萄糖甙、單寧等抗營養(yǎng)因子［1］，且蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大［2］，纖維物質(zhì)含量高，降低了其作為飼料的安全性、適口性，以及動物對其營養(yǎng)物質(zhì)利用率。因此，降低菜籽餅抗營養(yǎng)因子含量，改善其營養(yǎng)價值成為飼料開發(fā)行業(yè)的研究熱點?；瘜W脫毒、添加酶制劑、微生物發(fā)酵等方法是改善菜籽餅營養(yǎng)價值的主要手段，化學處理和添加酶制劑效果單一，成本高，而微生物發(fā)酵具有條件溫和，干物質(zhì)含量損失小，工藝條件簡單等優(yōu)勢。一方面微生物發(fā)酵能夠消除硫苷、纖維素和植酸等抗營養(yǎng)因子［3-5］;另一方面微生物分泌多種酶，能改善蛋白質(zhì)品質(zhì)，提高養(yǎng)分利用效率［6-7］。近年來，利用單菌固態(tài)發(fā)酵菜籽餅進行了大量研究，篩選出了一些具有特定功能的菌種，例如:枯草芽孢桿菌(Bac.)、里氏木霉等，但是發(fā)酵效果單一，菜籽餅品質(zhì)改善效果不明顯，不能用于生產(chǎn)上大規(guī)模使用［8］。研究表明混菌發(fā)酵可以同時產(chǎn)生多種酶，彌補單菌發(fā)酵的缺陷［3，9-10］。為了在改善菜籽餅蛋白質(zhì)品質(zhì)的同時，降低抗營養(yǎng)因子的含量，混菌發(fā)酵具有進一步研究的必要性。

本研究以菜籽餅為原料，優(yōu)化枯草芽孢桿菌、黑曲霉(Asp.)和白地霉(Geo.)混菌固態(tài)發(fā)酵(SSF)條件，在最佳發(fā)酵條件下，摸索物質(zhì)變化規(guī)律，并結(jié)合中試發(fā)酵驗證，考察SSF對菜籽餅營養(yǎng)價值和抗營養(yǎng)因子含量的影響，為新型生物蛋白質(zhì)飼料的開發(fā)及菜籽餅的合理利用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養(yǎng)基

菌種:枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白地霉均購于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;菜籽餅購于四川省雅安市農(nóng)牧市場，為來自同種加工工藝(高溫壓榨，溫度為130℃)的不同批次產(chǎn)品;麥麩購于四川省雅安市農(nóng)牧市場。

發(fā)酵底物:菜籽餅 90%，麥麩 10%，尿素1.4%，加入一定量的水分攪拌均勻，自然pH。

菌種培養(yǎng)液:馬鈴薯培養(yǎng)液，馬鈴薯200 g(去皮，切成小塊煮沸30 min，紗布過濾)、蔗糖20 g、蒸餾水定容至1 000 mL，自然 pH，112℃滅菌20 min。牛肉-蛋白胨培養(yǎng)液，牛肉膏10 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH，112 ℃滅菌20 min。

1.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

小試發(fā)酵步驟:1)將36 g菜籽餅和4 g麥麩裝入250 mL三角瓶中，按一定料水比量取水，將0.56 g尿素溶于水中，加入三角瓶攪拌均勻，封口膜封口，115℃滅菌18 min。2)出鍋后冷卻，將菌種培養(yǎng)液以一定的接種量接入滅菌的發(fā)酵底物中，攪拌均勻，在28～30℃培養(yǎng)箱中封口發(fā)酵，每天定時翻料。發(fā)酵過程中定時取樣，90℃恒溫烘箱中滅酶活30 min，再在65℃烘干至恒重，待測。

接種量的計算:菌種接于菌種培養(yǎng)液，28℃條件下，恒溫搖床上培養(yǎng)24 h的菌液混勻，稀釋至吸光度值(OD)為1.5個單位，總接種量一定，為發(fā)酵底物總重的百分比。

以有效氮、小肽和硫苷降解率作為主要評判指標，確定發(fā)酵最佳條件。1)采用2×4雙因素試驗，考察枯草芽孢桿菌添加時間(3種菌同時添加、發(fā)酵3 d添加枯草芽孢桿菌)、菌種比例(黑曲霉∶白地霉∶枯草芽孢桿菌分別為 1∶1∶1、1∶1∶2、2∶1∶2、1∶1∶3)對發(fā)酵效果的影響。2)采用3×3雙因素試驗，考察料水比(1.0∶1.0、1.0∶1.5 和 1.0∶2.0)和接種量(12%、16%、20%)對發(fā)酵的影響。3)按得出的以上因素最佳條件，在發(fā)酵的不同時間(0、1、2、3、4、5 d)取樣，烘干，制成風干樣品，測定有效氮、小肽、游離氨基酸、硫苷、粗纖維(CF)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)、酸性洗滌木質(zhì)素(ADL)的含量，以確定最佳發(fā)酵時間。

1.3 最佳發(fā)酵條件下菜籽餅的變化

1.3.1 中試發(fā)酵試驗方法

參照前期優(yōu)化條件，采用白地霉、黑曲霉和枯草芽孢桿菌SSF，發(fā)酵混合物在消毒滅菌室靜止發(fā)酵4 d，每天翻料1次。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵產(chǎn)品90℃恒溫烘箱中滅酶活30 min，再風干樣品得到發(fā)酵菜籽餅。

發(fā)酵混合物組成為:菜籽餅108.00 kg、麥麩12.00 kg、水 100.80 L、尿素 1.68 kg，噴灑枯草芽孢桿菌11.52 L、黑曲霉和白地霉分別為3.84 L，混勻?？疾熘性嚢l(fā)酵前后營養(yǎng)物質(zhì)及抗營養(yǎng)因子含量變化、發(fā)酵前后菜籽餅形態(tài)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)分子大小變化。

1.3.2 形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測

菜籽餅形態(tài)結(jié)構(gòu)檢測采用電鏡掃描(SEM)法［11］。

1.3.3 蛋白質(zhì)分子組成檢測

菜籽餅蛋白質(zhì)的提取:采用植物總蛋白質(zhì)微量提取試劑盒提取菜籽餅總蛋白質(zhì)，置于4℃冰箱放置，待用。

三甲基甘氨酸-十二烷基四乙酸二鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Tricine-SDS-PAGE):參照Sch?gger［12］的方法，使用由 4% 濃縮膠、10% 隔離膠、16%分離膠從上到下組成的3層Tricine-SDSPAGE膠。每條泳道加樣量為20μL蛋白質(zhì)提取液，20 mA恒流電泳4～5 h，考馬斯亮藍染色。

1.3.4 常規(guī)養(yǎng)分、氨基酸和抗營養(yǎng)因子含量測定

粗蛋白質(zhì)(CP)采用凱氏定氮法測定;有效氮含量為凱氏定氮法測得的CP含量減去非蛋白氮含量;游離氨基酸和尿素采用全自動氨基酸分析儀(日本日立L-8800)測定;水解氨基酸采用全自動氨基酸分析儀(日本日立L-8900)測定;小肽測定參照GB/T 22492—2008;干物質(zhì)(DM)采用烘箱干燥法測定;粗脂肪(EE)采用索氏抽提法測定;ADF、NDF、ADL、CF采用濾袋法測定;硫苷、異硫氰酸酯(ITC)和唑烷硫酮(OZT)的測定分別參照 NY/T 1596—2008、NY/T 1799—2009、NY/T 1582—2007，硫苷所用的標準品是烯丙基硫苷。

硫苷降解率(%)=100×(發(fā)酵前硫苷含量-發(fā)酵后硫苷含量)/發(fā)酵前硫苷含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0統(tǒng)計軟件中的一般線性模型分析，結(jié)合Duncan氏法進行多重比較，發(fā)酵過程物質(zhì)含量變化采用相關性檢驗后進行線性回歸分析。試驗結(jié)果用平均值±標準誤表示，P＜0.05作為差異顯著性標準。

2 結(jié)果

2.1 混菌發(fā)酵最佳條件(小試發(fā)酵)

通過對發(fā)酵條件的選擇，以有效氮、小肽和硫苷降解率作為主要評判指標，優(yōu)化出的最佳發(fā)酵條件為:3種菌同時添加，接種比例為黑曲霉∶白地霉∶枯草芽孢桿菌 =1∶1∶3，接種量為 16%，料水比 =1∶1，發(fā)酵 4 d。

2.2 發(fā)酵時間對最佳發(fā)酵條件下菜籽餅常規(guī)養(yǎng)分的影響(小試發(fā)酵)

由表1可知，發(fā)酵時間與各常規(guī)養(yǎng)分(除CF外)含量呈線性相關;從發(fā)酵第0～4天，有效氮、小肽、游離氨基酸含量均顯著提高(P＜0.05)，ADF和NDF含量顯著降低(P＜0.05)，而在第4天和第5天變化不顯著(P＞0.05)。硫苷和ADL的含量到發(fā)酵第5天仍出現(xiàn)顯著性下降(P＜0.05)。發(fā)酵后，有效氮、小肽、游離氨基酸含量分別提高了 13.44%、126.52% 和 2 426.92%，硫苷含量下降了51.96%，NDF下降了38.70%，ADF含量下降了27.88%。

表1 發(fā)酵時間對最佳發(fā)酵條件下菜籽餅常規(guī)養(yǎng)分的影響Table 1 Effects of fermentation time on common nutrients of rapeseed cake under optimal fermentation process %

2.3 最佳發(fā)酵條件下菜籽餅的變化(中試發(fā)酵)

2.3.1 形態(tài)

由圖1可知，菜籽餅在發(fā)酵前網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)清晰，表面光滑，排列緊密;發(fā)酵后網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，表面松散、粗糙，孔隙增加，小顆粒物增多。

2.3.2 蛋白質(zhì)分子組成

由圖2可知，菜籽餅蛋白質(zhì)分子質(zhì)量主要在60 ku以內(nèi)，菜籽餅發(fā)酵后，大分子蛋白質(zhì)(＞20 ku)減少，分子質(zhì)量主要集中在5.8 ku左右，中試發(fā)酵與小試發(fā)酵具有相似的結(jié)果，但中試發(fā)酵20 ku以上大分子質(zhì)量條帶幾乎消失。

圖1 菜籽餅發(fā)酵后形態(tài)變化Fig.1 Morphologic changes of rapeseed cake after fermentation

圖2 菜籽餅發(fā)酵后蛋白質(zhì)分子組成變化Fig.2 Changes of protein molecular composition of rapeseed cake after fermentation

2.3.3 抗營養(yǎng)因子含量

由表2可知，發(fā)酵后抗營養(yǎng)因子的含量降低，其中硫苷含量由10.04μmol/g降低到0.65 μmol/g，降 幅達 到 93.53%;OZT 降低了36.00%，ITC 完全被降解;CF、NDF、ADF、ADL 分別下降了 12.75% 、7.20% 、11.42% 、10.46% 。

2.3.4 常規(guī)養(yǎng)分和氨基酸含量

由表3可知，有效氮、小肽、游離氨基酸含量分別提高了 21.27%、385.19%、300.00%，EE 的含量卻降低了36.61%。水解氨基酸中賴氨酸(Lys)、苯丙氨酸(Phe)和酪氨酸(Tyr)的含量分別提高了 22.73%、20.39% 和 20.51%，但是，蛋氨酸(Met)降到0.44%，降低了30.16%，其他氨基酸含量變化不大。

3 討論

3.1 SSF條件對菜籽餅發(fā)酵效果的影響

微生物發(fā)酵是改善菜籽餅營養(yǎng)價值的重要途徑之一。研究表明，枯草芽孢桿菌是α-淀粉酶和中性蛋白酶的重要生產(chǎn)菌，能產(chǎn)胞外蛋白酶，用它發(fā)酵菜籽餅可以降低其蛋白質(zhì)分子質(zhì)量，增加小肽的含量［6，13-14］;白地霉是一種類酵母真菌，在食品及飼料行業(yè)上進行了大量的研究，白地霉發(fā)酵可提高蛋白質(zhì)含量，生產(chǎn)飼料酵母［15-18］;黑曲霉可以降低菜籽餅的硫苷及纖維類物質(zhì)含量［19-20］。但是，利用白地霉、黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合固態(tài)發(fā)酵的研究還未見報道［21］。大量研究得出，SSF主要受溫度、水分、菌種接種量和菌種接種比例的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，菌種接種比例和料水比對發(fā)酵結(jié)果具有顯著影響，隨著枯草芽孢桿菌添加比例的增加，小肽和游離氨基酸含量顯著增加，這主要是由于枯草芽孢桿菌產(chǎn)中性蛋白酶，產(chǎn)酶量會隨著菌種量的增加而增加，接種比例為黑曲霉∶白地霉∶枯草芽孢桿菌=1∶1∶3時小肽含量最高。研究表明，SSF料水比一般在 1.0∶0.8～1.0∶1.5［15，22-23］，本試驗結(jié)果顯示，料水比 =1∶1 時發(fā)酵效果最好。接種量的選擇，各研究者報道不一樣，變化范圍在5% ～25%，原因是菌體計量方式和發(fā)酵條件的差異。

表2 發(fā)酵后菜籽餅抗營養(yǎng)因子含量變化(干物質(zhì)基礎)Table 2 Changes of antinutritional factor contents of rapeseed cake after fermentation(DM basis)

表3 發(fā)酵后菜籽餅常規(guī)養(yǎng)分和氨基酸含量的變化(干物質(zhì)基礎)Table 3 Changes of the contents of common nutrients and amino acids of rapeseed cake after fermentation(DM basis) %

3.2 SSF菜籽餅的物質(zhì)變化規(guī)律

固態(tài)發(fā)酵改善發(fā)酵底物營養(yǎng)價值，降低抗營養(yǎng)因子含量，主要是由于微生物產(chǎn)生功能性酶的作用。本研究發(fā)現(xiàn)在一定時間內(nèi)，隨著發(fā)酵的進行，物質(zhì)呈現(xiàn)一定線性變化規(guī)律，有效氮、小肽和游離氨基酸含量都呈線性增加，而硫苷和纖維類物質(zhì)呈線性降低，這與Adebowale等［24］研究木豆粉發(fā)酵規(guī)律一致。但是在發(fā)酵第4～5天，小肽和游離氨基酸含量變化趨于穩(wěn)定，分析可能原因是，芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵最佳發(fā)酵時間一般在36～72 h［25-26］，發(fā)酵到后期，菌落進入衰亡期，次級代謝產(chǎn)物分泌增加，培養(yǎng)基溫度升高，蛋白酶的產(chǎn)量降低導致小肽和游離氨基酸含量增加速度變慢。較細菌而言，霉菌的最佳培養(yǎng)時間長，達到產(chǎn)酶高峰期的時間也較長，研究用黑曲霉發(fā)酵大豆皮和麥麩產(chǎn)纖維素酶時，在發(fā)酵96 h獲得最高的產(chǎn)酶量［20］，在 72 h 纖維素酶達到最佳產(chǎn)量［27］，生長的不同步性表明枯草芽孢桿菌達到衰亡期，此時白地霉和黑曲霉還處在生長旺盛期，產(chǎn)酶量仍然較高，因此在發(fā)酵的第5天仍然有顯著的變化。

3.3 SSF菜籽餅的化學結(jié)構(gòu)變化

從形態(tài)學觀測，菜籽餅發(fā)酵后結(jié)構(gòu)由光滑變得疏松多孔，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)消失，分析原因可能是由于菌株分泌的酶的水解作用，使纖維結(jié)構(gòu)受到破壞，這也是發(fā)酵后纖維物質(zhì)的含量下降的一個重要原因;由于酶的水解作用首先發(fā)生在物質(zhì)的表面，逐步進入物質(zhì)內(nèi)部，從而產(chǎn)生了不同程度的疏松和孔隙［28］;結(jié)構(gòu)疏松多孔，將增加消化酶的接觸面積，從而更有利于動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

菜籽餅的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)受多種因素的影響，包括油菜籽品種、加工工藝條件等。研究表明，菜籽餅的蛋白質(zhì)含量一般在30%以上，主要由球蛋白和白蛋白組成，還有一部份硫素蛋白、胰蛋白酶抑制因子等，氨基酸組成比較平衡［2］，但受加工過程的影響一些含硫氨基酸受到破壞，本研究中菜籽餅水解氨基酸含量與李波等［29］及中國飼料成分及營養(yǎng)價值表(2010年)報道相近，但本試驗中半胱氨酸(Cys)含量較低。動物對蛋白質(zhì)及氨基酸的消化利用率是評判飼料蛋白質(zhì)品質(zhì)的主要標準，而飼料中蛋白質(zhì)分子質(zhì)量越小，氨基酸組成越平衡，小肽含量越高，越容易被動物消化吸收。從蛋白質(zhì)電泳圖可以觀測到，菜籽餅是由多條不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)條帶組成，發(fā)酵后蛋白質(zhì)分子明顯集中在5.8 ku左右，表明發(fā)酵改變了蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，與王剛［22］的結(jié)果一致。發(fā)酵后，氨基酸含量發(fā)生變化，主要與微生物復雜的分解合成代謝過程有關，具體機理需要進一步研究，最后總必需氨基酸和總非必需氨基酸含量變化不大，有效氮、小肽和游離氨基酸含量顯著增加分別提高了21.27%、385.19%、300.00% ，揭示了小試優(yōu)化的發(fā)酵條件在中試發(fā)酵的可行性，也表明發(fā)酵后菜籽餅的蛋白質(zhì)品質(zhì)得到顯著提高。微生物發(fā)酵降低菜籽餅抗營養(yǎng)因子的研究較多，鞠興榮等［14］用枯草芽孢桿菌與宇佐美曲霉混菌發(fā)酵菜籽粕硫苷降解率最高達到79.49%，葉龍翔等［30］用黑曲霉、酵母菌和木霉(1∶2∶1)SSF硫苷降解率最高達到89.49%，王曉凡等［31］用多菌復合固態(tài)發(fā)酵菜籽粕硫苷降解率達到91.36%，本研究菜籽餅發(fā)酵后硫苷含量為 0.65 μmol/g，降低了 93.4%，OZT 完全被降解。硫苷及其代謝產(chǎn)物是菜籽餅中主要的抗營養(yǎng)因子，能夠降低動物采食量、蛋白質(zhì)的消化率和氨基酸的可利用率，影響甲狀腺功能等。不同動物品種對硫苷的耐受力不同，反芻動物、豬、兔子、家禽、魚類對其耐受范圍分別為 1.55～4.22 μmol/g、0.78、7.0、5.4、3.6 μmol/g［32］。由此可見，本試驗條件下發(fā)酵菜籽餅主要的抗營養(yǎng)因子已經(jīng)基本去除，對動物的安全性和適口性顯著提高，有利于動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

4 結(jié)論

①混菌固態(tài)發(fā)酵菜籽餅最佳的發(fā)酵條件為，3種菌同時添加，接種比例為黑曲霉∶白地霉∶枯草芽孢桿菌 =1∶1∶3，接種量為 16% ，料水比 =1∶1，發(fā)酵4 d。

②通過白地霉、黑曲霉和枯草芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵菜籽餅，能夠顯著提高有效氮、小肽和游離氨基酸含量，顯著降低硫苷及其代謝產(chǎn)物等抗營養(yǎng)因子的含量，有利于改善菜籽餅的飼用價值。

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